Бактериальные биосенсоры для оптимизации производства лекарств

В производстве лекарственных соединений генетически модифицированными бактериями есть узкое место: на идентификацию целевых молекул и отбор эффективных штаммов уходит много времени. Исследователи из Техасского университета в Остине разработали биосенсорную систему на основе E. coli, которую можно адаптировать для точного обнаружения всех видов терапевтических соединений всего за несколько часов.


Изображение

Бактерии E. coli, которых ученые использовали для создания биосенсора.

Credit:
123rf.com

У прокариот есть набор транскрипционных факторов, которые в присутствии определенных веществ перестают ингибировать активность целевого гена. Например, таким способом регулируется экспрессия генов антибиотикорезистентности. Однако получение новых транскрипционных факторов с повышенными показателями селективности и чувствительности — сложная задача.

В Nature Chemical Biology опубликована работа, авторы которой смогли разработать эффективный алгоритм для инженерии новых транскрипционных факторов прокариот. Идея ученых заключается в специализации «неразборчивого» белка на взаимодействии с одним конкретным лигандом. Исходя из этой концепции, исследователи создали конструкцию из трех генов. Первые два — кодировали репортерный зеленый флуоресцентный белок и белок λ cI. Перед каждым из этих генов находился сайт связывания с транскрипционным фактором. Третий ген, Sh ble, обеспечивал резистентность к антибиотику зеоцину и экспрессировался только в отсутствие λ cI.

Ученые провели трехступенчатую селекцию. На первом этапе они отсеивали E. coli, у которых лиганд-специфический рецептор работает в отсутствие лиганда. Для этого они выращивали бактерии в присутствии зеоцина. В таких условиях выживали только те из них, у которых нет белка λ cI и стабильно экспрессируется Sh ble. На втором этапе ученые отбирали флуоресцентные колонии в присутствии низкомолекулярного лиганда транскрипционного фактора. Для формирования селективного механизма связывания проводился третий этап скрининга — отбор колоний, которые реагируют только на целевой лиганд. Бактерии с наиболее эффективным биосенсором секвенировали и отбирали для последующей генерации.

«Мы даем бактериям своего рода чувствительные рецепторы, подобные обонятельным или вкусовым, и используем их для обнаружения различных соединений, которые бактерии могут производить», — сказал Эндрю Эллингтон, руководителей исследования.

Затем ученые нацелились на создание биосенсоров для пяти терапевтически значимых и коммерчески доступных соединений, которые принадлежат к структурно различным семействам бензилизохинолиновых алкалоидов. В качестве основы для конструирования новых белков, ученые взяли транскрипционный фактор RamR.

Высокочувствительные и селективные биосенсоры помогли исследователям сконструировать новые ферменты. В одном из селекционных экспериментов они специально выбрали в качестве лиганда тетрагидропапаверин — важный компонент фармацевтического сырья. Новый транскрипционный фактор назван THP4.1.

Обычно тетрагидропапаверин синтезируется из прекурсора норлауданозолин в несколько стадий метилирования. Используя THP4.1, ученые провели направленную селекцию метилтрансферазы, которая могла бы синтезировать тетрагидропапаверин в одну стадию из норлауданозолина. В эксперименте бактерии трансформировали норлауданозолин в тетрагидропапаверин, который взаимодействовал со THP4.1 и запускал экспрессию генов флуоресцентного белка. Используя ПЦР для мутагенеза в гене фермента, исследователи вели эволюцию в сторону увеличения интенсивности флуоресцентного сигнала. Интересно, что вместе с этим с каждой итерацией увеличивалось количество метилирований, которое обеспечивает фермент.

«В настоящее время нет биосенсоров для большинства растительных метаболитов», — сказал Саймон д'Ольснитц, первый автор статьи. — «С помощью этой технологии можно будет создавать биосенсоры для широкого спектра лекарств».

Источник

d’Oelsnitz, S. et al. Using fungible biosensors to evolve improved alkaloid biosynthesis // Nat Chem Biol. 2022. DOI: 10.1038/s41589-022-01072-w

Цитаты по пресс-релизу

Добавить в избранное

Вам будет интересно