Бактериальные биосенсоры для оптимизации производства лекарств

У прокариот есть набор транскрипционных факторов, которые в присутствии определенных веществ перестают ингибировать активность целевого гена. Например, таким способом регулируется экспрессия генов антибиотикорезистентности. Однако получение новых транскрипционных факторов с повышенными показателями селективности и чувствительности — сложная задача.

В Nature Chemical Biology опубликована работа, авторы которой смогли разработать эффективный алгоритм для инженерии новых транскрипционных факторов прокариот. Идея ученых заключается в специализации «неразборчивого» белка на взаимодействии с одним конкретным лигандом. Исходя из этой концепции, исследователи создали конструкцию из трех генов. Первые два — кодировали репортерный зеленый флуоресцентный белок и белок λ cI. Перед каждым из этих генов находился сайт связывания с транскрипционным фактором. Третий ген, Sh ble, обеспечивал резистентность к антибиотику зеоцину и экспрессировался только в отсутствие λ cI.

Ученые провели трехступенчатую селекцию. На первом этапе они отсеивали E. coli, у которых лиганд-специфический рецептор работает в отсутствие лиганда. Для этого они выращивали бактерии в присутствии зеоцина. В таких условиях выживали только те из них, у которых нет белка λ cI и стабильно экспрессируется Sh ble. На втором этапе ученые отбирали флуоресцентные колонии в присутствии низкомолекулярного лиганда транскрипционного фактора. Для формирования селективного механизма связывания проводился третий этап скрининга — отбор колоний, которые реагируют только на целевой лиганд. Бактерии с наиболее эффективным биосенсором секвенировали и отбирали для последующей генерации.

«Мы даем бактериям своего рода чувствительные рецепторы, подобные обонятельным или вкусовым, и используем их для обнаружения различных соединений, которые бактерии могут производить», — сказал Эндрю Эллингтон, руководителей исследования.

Затем ученые нацелились на создание биосенсоров для пяти терапевтически значимых и коммерчески доступных соединений, которые принадлежат к структурно различным семействам бензилизохинолиновых алкалоидов. В качестве основы для конструирования новых белков, ученые взяли транскрипционный фактор RamR.

Высокочувствительные и селективные биосенсоры помогли исследователям сконструировать новые ферменты. В одном из селекционных экспериментов они специально выбрали в качестве лиганда тетрагидропапаверин — важный компонент фармацевтического сырья. Новый транскрипционный фактор назван THP4.1.

Обычно тетрагидропапаверин синтезируется из прекурсора норлауданозолин в несколько стадий метилирования. Используя THP4.1, ученые провели направленную селекцию метилтрансферазы, которая могла бы синтезировать тетрагидропапаверин в одну стадию из норлауданозолина. В эксперименте бактерии трансформировали норлауданозолин в тетрагидропапаверин, который взаимодействовал со THP4.1 и запускал экспрессию генов флуоресцентного белка. Используя ПЦР для мутагенеза в гене фермента, исследователи вели эволюцию в сторону увеличения интенсивности флуоресцентного сигнала. Интересно, что вместе с этим с каждой итерацией увеличивалось количество метилирований, которое обеспечивает фермент.

«В настоящее время нет биосенсоров для большинства растительных метаболитов», — сказал Саймон д'Ольснитц, первый автор статьи. — «С помощью этой технологии можно будет создавать биосенсоры для широкого спектра лекарств».