Белок GRA12 необходим всем типам токсоплазмы для заражения мышей

Toxoplasma gondii — паразитический протист, способный заражать любую содержащую ядро клетку теплокровных животных, включая человека. В Европе и Северной Америке превалируют менее вирулентные типы II и III, инфекция которыми обычно протекает без симптомов. Более вирулентный тип I ассоциирован с осложнениями, нарушением зрения и пороками развития плода. В последние десятилетия исследователи в основном сосредоточились на факторах вирулентности, которые делают один штамм опаснее другого, а не на общих для всех штаммов факторах, позволяющих токсоплазме заражать того или иного хозяина. Исследователи из Великобритании и Португалии провели скрининг с помощью системы CRISPR-Cas9 и выявили один такой фактор — белок плотных гранул 12 (GRA12), позволяющий токсоплазме заражать три подвида мышей с разной чувствительностью к инфекции.

Токсоплазма избегает действия иммунной системы хозяина с помощью пула секретируемых белков, которые выделяют роптрии и плотные гранулы. Белки находятся внутри паразитофорной вакуоли, на ее мембране или выходят в цитоплазму хозяина. Известно о порядка 250 белках, функция большинства из них неясна. Авторы провели нокаут 253 потенциальных секреторных белков у штаммов RH ΔHXGPRT (RH), PRU ΔHXGPRT (PRU), VEG и VAND, которые принадлежат к типам I, II и III, а также к атипичным штаммам. Протистов вводили мышам, по пять мышей на штамм. Использовали мышей подвидов M. m. domesticus, M. m. musculus и M. m. castaneus. Более вирулентные штаммы вводили более резистентным линиям мышей. Через пять дней после заражения паразитов снова выделяли из организма животных и определяли их относительное количество до и после селекции in vivo.

Потеря белка GRA12 сильнее всего коррелировала с потерей жизнеспособности всех штаммов в теле хозяина при любом генетическом бэкграунде мышей. Чтобы валидировать результаты на атипичном штамме (при скрининге работа с ним была затруднена), авторы получили атипичный южноамериканский штамм VAND с делецией GRA12 (ΔGRA12). Мыши, зараженные штаммом ΔGRA12, выживали, в отличие от мышей, зараженных штаммом с интактным GRA12. У выживших мышей все равно образовывались цисты в мозге.

В острой фазе токсоплазма заражает в первую очередь макрофаги при попадании в брюшину мышей. Авторы провели скрининг с применением макрофагов мышей M. m. musculus PWD/PhJ. Как и в опытах in vivo, делеция GRA12 снижала жизнеспособность паразита. В макрофагах крыс и фибробластах человека такого эффекта не наблюдалось.

При заражении штаммом ΔGRA12 макрофаги быстро погибали путем некроза. Если обработать макрофаги IFNγ и заразить протистами ΔGRA12, то вокруг клеток-хозяев видно множество внеклеточных паразитов. Авторы предположили, что в отсутствие GRA12 в макрофагах развивается некроз из-за раннего выхода паразитов из клеток. Если заблокировать выход паразитов, то количество клеток, проходящих через некроз, снижается, но такие клетки все равно остаются, так что должен быть еще какой-то механизм, способствующий некрозу.

Белок GRA12 располагается внутри паразитофорной вакуоли в клетках мышей. Выявить, с какими белками взаимодействует GRA12, не удалось. Взаимодействие с ранее выявленными белками GRA2, ROP5 и ROP18 в новом исследовании не подтвердилось.

Без GRA12 вакуоль занимает значительно меньше места, она схлопывается, местами ее мембрана визуально сливается с плазматической мембраной паразита. Также в таких вакуолях присутствует меньше иммунных факторов организма-хозяина.

Ортологи GRA12 Hammondia hammondi и Neospora caninum больше всего похожи на белок токсоплазмы. Alphafold показал, что структура этих белков консервативна, вероятно, они играют схожие роли. Если ввести в токсоплазму ΔGRA12 белки из H. hammondi и N. caninum, то токсоплазма возвращает себе свойства дикого типа.

Используя скрининги с помощью системы CRISPR-Cas9 in vivo, авторы идентифицировали секретируемый фактор вирулентности, который обнаруживается у всех типов токсоплазмы и позволяет заражать мышей с различными генотипами. Делеция GRA12 неизменно оказывала наиболее выраженный эффект на выживаемость паразита в организме мыши.

Токсоплазма доставляет терапевтические макромолекулы в мозг мыши