Белок, содержащий четыре неканонические аминокислоты, впервые получен в E. coli

Исследователи из лаборатории молекулярной биологии Совета по медицинским исследованиям в Кембридже (Великобритания) разработали вычислительный алгоритм для дизайна систем ортогональной трансляции. Это позволило увеличить продукцию белка и создать систему, использующую 68-кодонный генетический код для синтеза белка с четырьмя неканоническими аминокислотами.

Расширение генетического кода (GCE) — метод, позволяющий вставлять неканонические аминокислоты (ncAA) в белки, транслирующиеся в клетке. Таким образом можно получать in vivo белки со специфическими функциями, например, флуоресцентные или ферменты, модифицированные под определенные задачи. Для вставки ncAA в белок используется ортогональная система из мРНК с неканоническими кодонами и пар аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS)/тРНК, эволюционно удаленных от клетки, в которой происходит трансляция. Кроме того, необходимы рибосомы, способные распознать неканонические кодоны.

Ортогональная трансляция в E. coli работает параллельно с канонической трансляцией. Неканонические кодоны расшифровываются парой ncAA/тРНК. Чтобы вставить в белки две-три разных ncAA, нужно использовать взаимно ортогональные пары ааRS/тРНК, работающие с разных кодонов. Чаще всего используют пары пирролизил-тРНК синтетаза (PylRS)/тРНК из архей. В прошлом году команда из Кембриджа на основе природных пар PylRS/тРНК сконструировала дважды и трижды ортогональные пары. Однако количество белка, полученного в ортогональных системах, было значительно ниже, чем на «хозяйской» фабрике с родными рибосомами, тРНК и мРНК. Эффективность трансляции может зависеть от вторичной структуры мРНК в 5'UTR и начале кодирующей последовательности. Было показано, что выход белка зависит от термодинамических параметров, а именно от константы равновесия сборки инициаторного комплекса.

Основываясь на этих данных, авторы новой работы адаптировали под ортогональную систему алгоритм для дизайна сайта связывания рибосом, изначально разработанный для канонической трансляции. С помощью алгоритма ученые добились достаточной избирательности связывания ортогональных рибосом и подобрали последовательности 5'UTR ортогональной мРНК, позволяющие получить в ортогональной системе в 40 раз больше белка, чем исходная О-мРНК. Для белка, в который включались три различных неканонических аминокислотных остатка, увеличение экспрессии было 33-кратным.

Затем ученые применили алгоритм для создания четырех взаимно ортогональных пар ааRS/тРНК, распознающих квадруплетные неканонические кодоны. За основу были взяты три пары PylRS/тРНК и пара тирозил-тРНК-ситетаза/тРНК из археи Archaeoglobus fulgidus. Итоговая ортогональная система состояла из О-мРНК, кодирующей модифицированный GFP и содержащей сразу четыре неканонических квадруплетных кодона, четырех пар ааRS/тРНК и рибосомы riboQ1. Продукция модифицированного белка в E. coli зависела от наличия всех четырех неканонических аминокислот. Включение их в белок было подтверждено с помощью масс-спектрометрии. Схема эксперимента приведена на иллюстрации.

Таким образом, авторы впервые получили in vivo белок, содержащий 24 аминокислоты: 20 канонических и четыре ncAA. Это означает, что в одной клетке может работать генетический код, состоящий из 68 кодонов. По мнению авторов, разработанный ими автоматизированный метод конструирования О-мРНК значительно ускорит дизайн и направленную эволюцию систем ортогональной трансляции.