Быстрый рост бактерий снижает накопление и эффективность антибиотиков

От бактериальных инфекций ежегодно в мире умирают пять миллионов человек, что в настоящее время связывают со способностью многих видов бактерий развивать резистентность к антибиотикам. Обычно это происходит из-за генетических изменений клетки или замедления метаболизма, при этом мало что было известно об индивидуальных различиях клеток при накоплении антибиотиков.

Международная группа ученых из США, Великобритании и Австралии выдвинула гипотезу, что эти различия могут быть обусловлены разной скоростью межклеточного транспорта лекарств. Для проверки гипотезы были использованы микрофлюидная микроскопия отдельных клеток, библиотека флуоресцентных производных основных классов антибиотиков и математическое моделирование. Этот подход позволил быстро выявить фенотипические варианты, которые избегают накопления антибиотиков, в популяциях Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cenocepacia и Staphylococcus aureus.

В эксперименте аликвоту бактериальной культуры помещали в специальное устройство с несколькими каналами, каждый из которых содержал от одной до шести клеток. Затем у бактерий индуцировали фазу экспоненциального роста, после чего в те же каналы подавали флуоресцентно меченный антибиотик. Благодаря такому подходу ученые смогли оценить накопление лекарства в каждой клетке.

После введения антибиотика ученые наблюдали фенотипическую гетерогенность в распределении антибиотика: некоторые клетки накапливали лекарство позже остальных. Эта закономерность оказалась не исключительной для E. coli и других грамотрицательных бактерий, похожие результаты были получены и у S. aureus, грамположительной бактерии.

Чтобы описать накопление антибиотиков, исследователи использовали модель с параметрами t₀, k₁ и F₀ (время начало накопления антибиотика, скорость его всасывания и уровень стационарного насыщения). После статистического анализа они поняли, что эти три параметра связаны между собой — t₀ отрицательно коррелирует с k₁, а k₁ положительно коррелирует с F₀.

Также ученые обнаружили, что по кинетическим параметрам антибиотика можно предсказать, нацелен он на внутриклеточную или мембранную мишень.

Кроме того выяснилось, что бактерии со сниженным накоплением антибиотиков выживают после обработки лекарствами. Ученые сосредоточились на макролиде рокситромицине, так как во многих фенотипах накапливалось пониженное количество этого соединения. В результате эксперимента исследователи нашли два типа клеточного ответа. Большинство клеток переставало расти во время действия препарата, однако некоторые клетки из того же клона продолжали увеличиваться в течение всего периода лечения. Статистический анализ данных показал, что время начала накопления антибиотика положительно коррелирует с увеличением клетки. Более того, темпы роста увеличивались от остро реагирующей бактерии к индифферентной.

Одной из причин такого явления ученые назвали расположение клеток в пределах микроколонии. Действительно, в клетках, которые находятся дальше всех от места ввода антибиотика, накопление шло с меньшей скоростью. Однако это было справедливо для мембранных антибиотиков. Накопление рокситромицина, нацеленного на рибосому, не зависело от положения клетки. Более того, время начала накопления было меньше всего у самой дальней клетки.

Тогда ученые нашли второй фактор, влияющий на накопление антибиотиков. Им оказался рост клетки до контакта с соединением. Исследователи обнаружили статистически значимую отрицательную корреляцию между временем начала накопления рокситромицина и скоростью роста бактерии. Эта находка противоречила современному мнению о замедленном метаболизме, как одним из способов резистентности к лекарству. Тем не менее ученые нашли и классический механизм защиты — при обработке тахиплезином рост клетки положительно коррелировал со скоростью его накопления.

Ученые связали каждый параметр накопления рокситромицина с экспрессией определенного гена. Так, уровень насыщения (F₀) отрицательно коррелировал с экспрессией рибосомных промоторов rrnB и rrnH, а время начала накопления рокситромицина t₀ — с активностью гена tolC, кодирующего канал в мембранных насосах MacAB-TolC и AcrAB-TolC. Также ученые предположили, что скорость всасывания антибиотика k₁ будет обусловлена количеством поринов во внешней мембране. Однако никаких корреляций между экспрессией порина ompC и величиной k₁ не обнаружено.

Таким образом, с помощью метода микрофлюидной микроскопии ученые обнаружили новый вид резистентности на уровне фенотипа. Устойчивые к рокситромицину бактерии, вопреки устоявшемуся мнению, ускоряют свой метаболизм, синтезируют много рибосом и мембранных насосов. Последние способствуют выведению антибиотика из клетки.