CAG-повторы в РНК переходят в состояние геля и подавляют биосинтез белка

Области микросателлитов, или коротких тандемных повторов, функционируют не так, как остальной геном. Это своего рода «горячие точки» эволюции, которые очень быстро меняются за счет так называемых динамических мутаций, то есть изменений числа повторяющихся единиц. Их нестабильность связана с ошибками при репликации ДНК и в случае удлинения области повторов иногда вызывает генетические заболевания. Если при этом «разрастаются» повторы из трех нуклеотидов, то это так называемые болезни тринуклеотидных экспансий. Распространенный случай — экспансии повторов CAG, которые являются причиной развития болезни Гентингтона и многих болезней из группы спиноцеребеллярных атаксий.

Разумеется, на матрице ДНК, содержащей повторы, синтезируется такая же мРНК, а затем повторы переходят и в последовательность белка. В случае CAG-повторов в кодирующей области белковый продукт содержит вставку из полиглутамина. Именно аномальные белки принято считать причиной нейродегенеративного процесса.

Однако коллектив авторов из Китая и Великобритании в новой статье для Nature Chemical Biology описал другой механизм токсичности микросателлитов. Он связан непосредственно с мРНК, имеющими области повторов CAG. Это согласуется с тем фактом, что возраст начала болезни Гентингтона коррелирует с длинной тринуклеотидных повторов, но не числом остатков глутамина в белке гентингтине.

Исследователи использовали клеточные культуры HEK293T и STHdh — трансгенные клетки полосатого тела мозга мыши, служащие моделью болезни Гентингтона. Для визуализации скоплений, которые образуют содержащие CAG-повторы участки РНК, авторы использовали шпильки фага MS2, которые коэкспрессировали со специфических связывающими их белком капсида, меченого флуоресцентным YFP.

Показано, что в клетках HEK293T скопления РНК с 47 повторами CAG локализованы главным образом в ядре, но не в цитоплазме. РНК с более короткими повторами при этом почти не образуют скоплений. Этот результат подтвердили методом FISH и при помощи использования меченых цианином 3 (Cy3) РНК.

Авторы предположили, что сгустки из молекул РНК с повторами исходно содержались и в цитоплазме, но быстро разрушались лизосомами. Они проверили свою гипотезу с помощью ингибиторов лизосом — хлорида аммония, хлорохина и бафиломицина A1. При их использовании в цитоплазме большинства клеток были заметны скопления РНК. Эксперименты показали, что это связано скорее с их замедленным разрушением, а не с быстрым образованием.

В ходе исследования авторы исключили участие макроаутофагии в наблюдаемых процессах. Они показали, что разрушение сгустков РНК происходит в лизосомах по механизму РНК-аутофагии — их прямого переноса в лизосомы с помощью мембранного белка LAMP2С; нокдаун гена Lamp2c вызвал появление в цитоплазме заметных сгустков РНК.

Конфокальная микроскопия подтвердила быстрое исчезновение скоплений РНК с CAG-повторами и их поглощение лизосомами. Метод FRAP позволил сравнить физические свойства сгустков РНК из ядра и цитоплазмы. Оказалось, что первые имеют свойство жидкости, вторые — твердого вещества. Это означает, что в цитоплазме скопления РНК с CAG-повторами переходят в состояние геля.

Далее в статье описано влияние сгустков РНК и их фазовых переходов на состояние клетки. Экспрессия РНК с 72 CAG-повторами быстро снизила общую скорость биосинтеза белка в клетке. Об этом свидетельствуют результаты электрофореза растущих полипептидных цепей, визуализация их синтеза и эксперименты с люциферазным репортером.

При экспрессии РНК с повторами той же длины, но другой последовательностью (CAA*CAG) биосинтез в клетке не нарушался, хотя белковая последовательность была такой же. Из этого следует, что эффект связан именно с образованием геля молекулами РНК с CAG-повторами. Авторы смогли ингибировать этот процесс, трансфицировав клетки так, чтобы те синтезировали олигонуклеотиды 8×CTG, комплементарно связывающие CAG-повторы.

Механизмы перехода «золь—гель» для РНК описали с помощью оптогенетики и чувствительного к синему свету белка Cry2. Оказалось, подавление трансляции вызвано скорее со сгустками РНК в цитоплазме, а не в ядре.

Рибосомальный профайлинг (опыты с полисомами), электрофорез и количественная ПЦР показали, что биосинтез замедляется не из-за нарушения сборки рибосом: различий между нормальными клетками и STHdh не оказалось.

В тоже время анализ продолжающих синтез белка рибосом, сохраняющих связь с полисомой (run-off assay), показал, что РНК с CAG-повторами нарушают элонгацияю. Действительно, в клетках STHdh и вообще клетках, где идет синтез РНК с CAG-повторами, наблюдается дефицит фактора элонгации eEF2. При этом экспрессия олигонуклеотидов 8×CTG повышает интенсивность синтеза белка в клетке, из чего следует: функцию eEF2 нарушает именно «гель из РНК». Авторы также выяснили, что для eEF2 и сгустков РНК характерна колокализация и, возможно, даже связывание этим гелем фактора элонгации.

Терапию болезни Гентингтона с использованием CRISPR-системы опробовали на свиньях