CRISPR-Cas13 с химически модифицированными гидовыми РНК успешнее выполняет нокдаун

Система CRISPR-Cas13, мишенью которой являются молекулы РНК, может быть мощным инструментом для регуляции экспрессии генов, однако ее применение ограничивает малая стабильность направляющих молекул crРНК в клетке. Ученые из США выявили химические модификации crРНК, которые повышают ее стабильность и точность распознавания мишени в клетках человека.

Работа проводилась на человеческий клетках линии HEK293FT, экспрессирующих белок RfxCas13d — ортолог Cas13d, обнаруженный у бактерии Ruminococcus flavefaciens. Этот белок может использоваться для нокдауна белков и модулирования сплайсинга. В качестве мишеней были выбраны обильно экспрессирующиеся поверхностные белки CD46, CD55 и CD71.

Ученые оценивали эффективность нокдауна соответствующих генов при использовании немодифицированных crРНК, crРНК с различными модификациями 3’-концевых остатках уридина, входящих в состав 23-нуклеотидной спейсерной последовательности, а также crРНК, несущих на 3’-конце инвертированный остаток тимидина, выступающий в роли кэпа. Предыдущие исследования показали, что стабильность РНК могут повысить следующие модификации 3’-концевых уридинов: 2’-O-метилирование, внедрение фосфоротиоатных связей, а также сочетание двух указанных модификаций.

Спустя три дня после введения немодифицированных crРНК эффект был незаметен. Модифицированные crРНК обеспечили некий уровень нокдауна мишеней, варьирующий для разных модификаций. Дальнейшие эксперименты показали, что эффективность нокдауна в клетках HEK293FT возрастает до 85%, если crРНК вводится в клетку в составе рибонуклеопротеиновых комплексов с белком rCas13d — нуклеазой, сшитой с сигналами ядерной локализации. При таком подходе обеспечивается активный транспорт комплекса в ядро.

Повышение эффективности нокдауна было продемонстрировано и на первичных человеческих иммунных клетках, а именно на T-лимфоцитах, взятых у здоровых доноров. Ученые провели в них нокдаун CD46 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов, включающих белок rCas13d и crРНК с 3’-фосфоротиоатной модификацией. Уровень экспрессии CD46 оценивали через 48 часов после введения рибонуклеопротеиновых комплексов. В случае введения немодифицированных crРНК эффективность нокдауна составляла 40–45%, а при использовании модифицированных crРНК возрастала до 60–65%. Авторы надеются, что вскоре их метод найдет применение в биотехнологии и медицине.