CRISPR-тест быстро и экономично выявляет туберкулез в мокроте с точностью до 100%

Туберкулез по-прежнему убивает более миллиона человек в год, и его раннее выявление остается одной из ключевых задач глобального здравоохранения. Однако стандартные культуральные методы диагностики занимают недели, микроскопия мазка мокроты выполняется в течение часа, но имеет ограниченную чувствительность и специфичность, а современные ПЦР-анализы требуют специфического оборудования и расходных материалов. В условиях сельских клиник или перегруженных городских поликлиник такие тесты часто недоступны. Группа ученых из нескольких университетов США и Международного медицинских исследований (CIDEIM, Колумбия) предлагает решение этой проблемы — быстрый и чувствительный тест, основанный на системе CRISPR и требующий минимальное количество недорогого оборудования.

Авторы поставили задачу создать инструмент, который мог бы объединить высокую специфичность CRISPR-диагностики с простотой применения в полевых условиях. Для этого они использовали разработанную ранее платформу SHINE (Streamlined Highlighting of Infections to Navigate Epidemics), адаптировав ее для M. tuberculosis. В основе SHINE-TB лежит изотермическая рекомбиназная полимеразная амплификация — метод, который, в отличие от ПЦР, не требует циклического нагрева и охлаждения. Реакция идет при постоянной температуре около 37 °C. Система детекции основана на двух параллельных реакциях: Cas13a распознает два консервативных участка бактериального генома (IS6110 и IS1081), а Cas12a служит внутренним контролем, узнавая повторяющийся элемент эндогенного ретровируса человека ERVK — это позволяет избежать ложных отрицательных результатов из-за плохой пробы или ошибок экстракции.

Подготовка образцов мокроты также адаптирована под условия без доступа к сложной технике. Вместо дорогих автоматических экстракторов ученые использовали метод с Chelex100 — смолой, связывающей ингибирующие примеси. Образец перемешивают с Chelex, нагревают и центрифугируют, получая очищенный супернатант, пригодный для прямого использования в реакции.

Также для максимально простого применения в полевых условиях SHINE-TB сделали совместимым с иммунохроматографией. Чтобы перевести сигнал CRISPR в видимую полоску, авторы заменили стандартные флуоресцентные репортеры на олигонуклеотиды, на одном конце которых расположен флуорофор (FAM), а на другом — биотин. Пока репортер цел, он захватывается на тест-полоске в зоне, где закреплен стрептавидин, и не дает верхней линии сигнала. Если же Cas13a или Cas12a активируются целевой последовательностью, они разрезают репортер, и его фрагменты мигрируют по капиллярному слою полоски, формируя видимую линию в тестовой зоне.

Принцип работы новой тест-системы.
Credit:
Science Advances (2025). DOI: 10.1126/sciadv.adx2067 | CC BY

В лабораторных испытаниях тест показал предел обнаружения 69,0 КОЕ/мл для штамма M. tuberculosis H37Rv и 80,5 КОЕ/мл для M. bovis BCG при отсутствии перекрестной реакции с 13 другими микобактериями и патогенами. На клинических образцах из Колумбии (слепое тестирование 13 проб) SHINE-TB продемонстрировал 100% чувствительность (6 из 6 положительных образцов) и 100% специфичность (7 из 7 отрицательных образцов).

Разработчики отмечают, что метод можно адаптировать для поиска генов лекарственной устойчивости или других инфекций, а также применять к альтернативным типам биоматериала, таким как слюна или мазок из ротовой полости. Таким образом, SHINE-TB соответствует целевым показателям ВОЗ для экспресс-тестов на туберкулез и способен радикально улучшить доступ к быстрой и точной диагностике в странах с ограниченными ресурсами, приближая цель — снизить глобальную смертность от этого заболевания.

Автономный чип выявляет туберкулезную палочку у ВИЧ-положительных людей лучше стандартного анализа