ДНК-нанопереключатели для высокочувствительной детекции вирусной РНК

Ученые из США разработали платформу для детекции РНК-вирусов в образцах с использованием ДНК-нанопереключателей (DNA nanoswitches). В статье, опубликованной в Science Advances, они описывают процесс адаптации платформы к клиническому применению.

ДНК-нанопереключатель — это ДНК-структура, которая меняет конформацию при контакте с таргетной нуклеотидной последовательностью. В «выключенном» состоянии нанопереключатель представляет собой линейный дуплекс, состоящий из одноцепочечной матрицы (последовательность фага M13) и набора комплементарных ей олигонуклеотидов. При этом два олигонуклеотида (детекторы) содержат участок, комплементарный таргетной последовательности. При связывании мишени с детекторами на нанопереключателе образуется петля, он переходит во «включенное» состояние. Присутствие мишени в образце определяется с помощью гель-электрофореза: «выключенный» и «включенный» нанопереключатели мигрируют в геле с разной скоростью.

Ученые подтвердили возможность детекции РНК-вирусов с помощью ДНК-нанопереключателей на вирусе Зика. Для экспериментов они использовали плазмиду pFLZIKV, содержащую полную последовательность генома вируса. РНК с плазмиды транскрибировалась in vitro.

Так как длинная РНК вируса может образовывать вторичные структуры, снижающие вероятность ее связывания с нанопереключателем, авторы расщепили ее на фрагменты короче 200 нуклеотидов. Детекция фрагментированной РНК вируса Зика с помощью одного нанопереключателя прошла успешно. Ученые повысили чувствительность платформы, сконструировав множество нанопереключателей, каждый из которых распознавал свой участок вирусного генома. При использовании комбинации из 18 ДНК-переключателей система детектировала РНК вируса Зика в концентрации 2,1×10⁶ копий в 10 мкл реакционной смеси.

Специфичность платформы подтвердили на геномах вирусов Зика и денге. Было показано, что нанопереключатели, распознающие вирус Зика, не реагируют на вирус Денге, и наоборот. Авторы сконструировали нанопереключатели для детекции вирусов Зика и денге таким образом, что при связывании с мишенями они мигрировали в геле с разной скоростью. Это дало возможность одновременно выявлять присутствие РНК двух возбудителей в смеси. Далее ученые показали, что аналогичным образом можно дифференцировать штаммы одного возбудителя, например, штаммы вируса Зика из Камбоджи (FSS13025) и Уганды (MR766).

Детекции РНК патогена в биологических жидкостях могут мешать нуклеазная активность и вариабельность вирусной нагрузки у пациентов. Для преодоления этих ограничений авторы предложили два подхода: дополнительная обработка клинических образцов для экстракции РНК или предварительная амплификация. Ученые имитировали инфицированные клинические образцы, смешивая частицы вируса Зика с человеческой мочой. Для проверки первого подхода они использовали коммерческие наборы для выделения РНК и добились чувствительности 1,7×10⁵ копий вирусных геномов в 1 мл. Второй подход предполагает использование техники изотермической амплификации РНК NASBA. Эта техника позволила увеличить чувствительность метода до 10² копий/мл и сократить время анализа до пяти часов.

Наконец, ученые показали, что с помощью ДНК-нанопереключателей и стратегии NASBA можно детектировать РНК SARS-CoV-2. Метод позволял обнаружить транскрибированную in vitro РНК нового коронавируса в человеческой слюне в минимальной концентрации 200 копий/мл.

Авторы отмечают, что анализ с помощью ДНК-нанопереключателей не требует сложной лабораторной инфраструктуры, а потому имеет относительно низкую стоимость. Они утверждают, что процесс конструирования и очистки нанопереключателей быстрый и несложный: платформу можно адаптировать к новому вирусному патогену в течение одного-двух дней с момента получения последовательности-мишени, что позволит снизить экономический и демографический ущерб от эпидемии.