«ДНК-салат» связывает флуорофор зеленого флуоресцентного белка

ДНК сильно уступает по структурному разнообразию РНК и тем более белкам. И все же селекция in vitro позволила создать молекулы ДНК, выполняющие сложные биохимические и биофизические функции. Подобно РНК-аптамерам или рибозимам, такие молекулы образуют сложные трехмерные структуры, однако особенности этих структур в атомарном масштабе изучены недостаточно.

Пробел восполняет новая публикация исследователей из США и Китая в Nature. Она посвящена «ДНК-салату» (DNA Lettuce). Эта молекула, описанная в статье 2022 года, связывает хромофор зеленого флуоресцентного белка GFP, то есть является ДНК-аптамером.

Флуоресцентные белки, подобные GFP, в присутствии кислорода автокаталитически формируют из собственных аминокислот хромофор (флуорофор) — структуру, отвечающую за способность молекулы поглощать и испускать свет. «Отдельно взятые» флуорофоры флуоресцентных белков, а также их производные могут образовывать комплексы с другими макромолекулами, при этом они приобретают способность флуоресцировать за счет стабилизации или модификации структуры . Вне комплекса флуорофор не флуоресцирует.

Ранее были описаны РНК-аптамеры, взаимодействующие с флуорофором GFP. (Традиционно они получают «зеленые» названия, среди них уже есть Spinach и Broccoli.) Структуру некоторых из них удалось охарактеризовать. Преимущество ДНК-аптамеров перед РНК-аптамерами в том, что они не подвержены деградации РНКазами и могут найти более широкое применение. Молекула DNA Lettuce была разработана для детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 — ее модифицировали таким образом, что флуоресценцию индуцировало связывание РНК-мишени.

Новая статья описывает структуру комплекса DNA Lettuce—флуорофор с разрешением 2,5 ангстрема для трех аналогов флуорофора GFP: DFHBI-1T, DFHO и DFAME. Структура получена с помощью рентгеновской кристаллографии и криоэлектронной микроскопии.

Функциональная часть «ДНК-салата» состоит из 53 пар оснований; длина ее трехмерной формы — примерно 66 ангстремов. Молекула содержит четырехконечную структуру (four-way junction, 4WJ). Обычно 4WJ образуют L- или H-образные формы. Но в DNA Lettuce участки ДНК располагаются коаксиально (однонаправленно), формируя в центре молекулы антипараллельный G-квадруплекс, который и связывает флуорофор. Эта трехмерная структура фланкирована двумя участками двойной спирали в В-форме. Наличие G-квадруплекса в комплексе подтверждают спектроскопия кругового дихроизма и полученные ранее биохимические данные.

По данным криоэлектронной микроскопии и полученной на ее основе карты распределения электростатического потенциала, при связывании лиганда ДНК сохраняет мономерную форму и в целом исходную структуру. Преобладание мономерных аптамеров подтверждают мультиракурсное светорассеяние и эксклюзионная хроматографии.

Авторы сравнили комплексы флуорофоров DFHBI-1T, DFHO и DFAME с различными вариантами DNA Lettuce, в которую вносили изменения с помощью сайт-специфического мутагенеза. В целом комплексы стабилизировались одними и теми же взаимодействиями между функциональными группами. Авторы обнаружили мутации, которые делают флуоресценцию комплекса невозможной или, напротив, активируют ее. Интересно, что мутации, затрагивающие цитозин в положении 20, по-разному влияли на связывание различных флуорофоров, что указывает на роль этого нуклеотида в узнавании молекул. Сильно снижали способность к связыванию замены некоторых дезоксирибонуклеотидов на соответствующие рибонуклеотиды. Очевидно, это говорит о важности более плотной укладки молекулы ДНК по сравнению с РНК.

Молекулу DNA Lettuce стабилизируют многочисленные стэкинг-взаимодействия и сеть водородных связей. Также для нее характерны необычные диагональные спаривания нуклеотидов, которые соединяют соседние коаксиальные «стопки», и координационные связи с участием одновалентных и двухвалентных катионов. Флуоресценция комплекса зависела от концентрации ионов магния.

Помимо этого, авторы предложили подходы к оптимизации структуры DNA Lettuce, а также созданию на его основе репортерных конструкций к R-петлям — участкам ДНК, вытесненным из дуплекса комплементарной РНК. Подобные структуры возникают в клетке при рекомбинации, репарации, репликации и транскрипции.

Таким образом, ДНК может образовывать сложные трехмерные структуры без РНК-подобных третичных взаимодействий. Это расширяет представления о нуклеиновых кислотах и их функциональных возможностях.