Джамбо-фаг не только строит «ядро» в клетке бактерии, но и селективно импортирует в него белки

Как показали авторы новой статьи в Nature, джамбо-фаги, которые формируют в клетке-хозяина «ядро», защищающее их геном, имеют механизмы для селективного импорта нужных белков через оболочку «ядра».

Джамбо-фаги (гигантские фаги) — имеющие хвост бактериофаги с геномом более 200 т.п.н., то есть существенно более крупным, чем у других фагов. Большой размер генома означает и большее количество генов, то есть большую независимость от хозяина и наличие необычных приспособлений, защищающих фага от «иммунной системы» прокариот. Не так давно было установлено, что некоторые джамбо-фаги, попадая в бактериальную клетку, формируют в цитоплазме жертвы «ядро», построенное из белков, а не из липидных мембран (подробнее на PCR.NEWS). Фаги, способные формировать подобные структуры, вызывают инфекции у ряда грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Erwinia, Vibrio и Salmonella.

У бактерий есть множество механизмов защиты от бактериофагов, в том числе системы рестрикции-модификации и CRISPR-Cas, расщепляющие фаговые ДНК или РНК. Белковое «ядро» защищает реплицирующийся геном фага от бактериальных ферментов. (При этом РНК фага, которые транскрибируются в цитоплазме бактерии-хозяина, все равно остаются уязвимыми, например, для систем CRISPR-Cas, нацеленных на РНК.)

«Ядро» джамбо-фага состоит из одного белка, который называют чималлин (ChmA), от «чималли» — ацтекский щит, или PhuN (phage nuclear enclosure). Под «щитом» из ChmA находится геномная ДНК фага. Через сетку, образованную этим белком, могут проникать различные фаговые белки и по крайней мере один белок хозяина. Но как достигается эта селективность и как белки транспортируются внутрь, оставалось непонятным.

В отличие от импортинов, с которыми связываются белки при транспорте в ядро эукариотической клетки, аналогичные белки у джамбо-фагов пока не были идентифицированы. Авторы исследования с помощью генетического скрининга выявили белки, обеспечивающие транспорт через белковую оболочку «ядра» фага ΦKZ, который заражает синегнойную палочку (Pseudomonas aeruginosa).

В ядро ΦKZ не должна проникать бактериальная эндонуклеаза рестрикции (рестриктаза) EcoRI, иначе бы она порезала геном вируса. Чтобы определить белки, отвечающие за транспорт в «ядро» джамбо-фага, ученые сшивали EcoRI с фаговыми белками Nlp, которые локализованы в «ядре», следовательно, могут проникать через его оболочку. Когда такую конструкцию экспрессировали в бактерии, она попадала в «ядро» и разрезала геном вируса (кстати, это подтверждало, что происходит активный транспорт полезных для фага белков, а не препятствование транспорту вредных). Авторы также включили в белковую конструкцию флуоресцентный белок и подтвердили ее локализацию в «ядре» с помощью микроскопии.

Импорт конструкции с EcoRI приводил к гибели фага, он терял способность лизировать бактерии. В частности, титр фага падал в 10⁶–10⁷ раз после доставки в ядро белков Nlp1, Nlp2, Nlp3 и Nlp4, сшитых с EcoRI. Авторы предположили, что это будет вызывать селективное давление: у фага появятся мутации, препятствующие опасному импорту, и, очевидно, они затронут неизвестные белки-импортины.

Таким способом было обнаружено несколько белков, мутации в которых снижали импорт других белков в «ядро». Белки, названные Imp1 и Imp3, оказались консервативными у всех формирующих «ядро» фагов, а Imp2, Imp4 и Imp5 — уникальными для джамбо-фагов, инфицирующих бактерии рода Pseudomonas. Кроме того, был обнаружен белок Imp6, который взаимодействует с Imp5. Авторы показали, что Imp1 связывается с белковой оболочкой «ядра».

Исследование различных мутаций, изменяющих последовательность белка Imp1, показало, что у него есть особые зоны связывания для различных «грузов»: мутация, затрагивающая одну из зон, снижала транспорт одного определенного белка, но не других. Моделирование с помощью AlpaFold2 выявило пять таких зон.

По мнению исследователей, Imp1 — главный фактор транспорта белков в фаговое «ядро». Оказалось, что по функциям у него нет гомологов. Дальнейшие исследования показали, что Imp1 может работать только в присутствии Imp3. Сам же Imp3 взаимодействует с Imp6 и Imp2. Наконец, Imp6 и Nlp2 также взаимодействуют с Imp1.

Авторы работы предложили следующий механизм импорта белков в «ядро» джамбо-фага. Imp1 располагается рядом с «ядром», а затем, вероятно, совместно с Imp6 формирует в нем небольшое отверстие. (Альтернативные возможности — механизмы, подобные флиппазе или анфолдазе.) Для импорта некоторых белков необходимо участие Imp3. Кроме того, неконсервативые фаговые белки Imp2 и Imp4/Imp5 выступают как адаптеры для двух грузов (фагового белка Nlp1 и бактериальной топоизомеразы А, нужной фагу). Таким образом, ключевую роль в импорте белков в ядро джамбо-фага играют белки Imp1, Imp3 и Imp6.

Помимо значительного теоретического интереса, эти открытия могут повысить эффективность фаготерапии, сообщается в пресс-релизе. Лаборатория руководителя работы Джозефа Бонди-Деноми (Калифорнийский университет в Сан-Франциско) разработала метод на основе CRISPR, позволяющий вносить изменения в геномы данной группы фагов, который будет полезен для дальнейших исследований.

Холерный вибрион против бактериофага: битва малых РНК