EchoBack — CAR Т-клетки, активируемые ультразвуком

Терапия CAR T-клетками успешно применяется при лейкозах, однако лечение солидных опухолей сопряжено с рядом ограничений. Например, часто встречается специфическая в отношении мишени внеопухолевая токсичность (on-target off-tumor toxicity), так как антигены, экспрессия которых повышена у опухолей, также встречаются и в нормальных тканях. Кроме того, из-за постоянной активации Т-клетки истощаются. Ученые из США совместно с компанией Acoustic Cell Therapy решили проблему специфической внеопухолевой токсичности и истощения, создав CAR T-клетки, активируемые ультразвуком.

Авторы разработали чувствительный к стимуляции сфокусированным ультразвуком промотор, под действием которого и находится ген химерного рецептора Т-клеток. К минимальному промотору YB-TATA исследователи присоединили элемент теплового шока (HSE, heat shock element), который получили из последовательности промотора белка теплового шока HSP70. HSE активируется за счет связывания с транскрипционным фактором теплового шока HSF только в стрессовых условиях. Для отбора наиболее эффективных вариантов HSE ученые провели скрининг при помощи сайт-насыщенного мутагенеза и технологии Sort-seq: Т-клетки трансдуцировали по одному варианту HSE на клетку, а затем отбирали те клетки, в которых в обычных условиях не было экспрессии флуоресцентного белка EGFP, контролируемой этим промотором, а при тепловом шоке она возникала. В результате у отсортированных клеток можно было определить генотип и отобрать наиболее эффективные версии мутированной последовательности HSE.

Промотор, содержащий HSE, активировал CAR против ганглиозида GD2 — маркера глиобластомы. Для оптимальной экспрессии этого крупного трансмембранного белка потребовалось модифицировать промотор таким образом, чтобы HSE повторялся в нем семь раз. В нормальных условиях Т-клетки, несущие такую конструкцию, не экспрессировали химерный рецептор, а при тепловом шоке экспрессия белка повышалась в 4–5 раз по сравнению с исходным HSE.

Исследователи также захотели, чтобы после временного столкновения с опухолью CAR T-клетки продолжали экспрессировать на своей поверхности химерные рецепторы. Для этого они внедрили цепь положительной обратной связи: в промотор добавили элементы, чувствительные к активации сигналинга NF-kB, NFAT, cAMP и MAPK. В результате после столкновения с опухолевыми клетками в Т-клетках запускались указанные сигнальные пути, что стимулировало их «выставлять» на своей поверхности химерные рецепторы. In vitro такие CAR T-клетки могли эффективно уничтожать опухоли даже при низком соотношении эффекторных клеток к целевым (1:4). Благодаря внедрению петли положительной обратной связи CAR T-клетки лучше пролиферировали и более эффективно подавляли рост опухоли. Без этой модификации через 48 часов эффективность Т-клеток снижалась, наблюдался рецидив роста опухоли.

CAR T-клетки с семью повторами модифицированного HSE и петлей положительной обратной связи назвали EchoBack-CAR Т-клетками. Через четыре часа после теплового шока (43℃, 15 мин) Т-клетки начинали экспрессировать свои химерные рецепторы, экспрессия достигала пика через 6 часов. Для оценки цитотоксичности использовали 3D-сфероид из клеток глиобластомы U-87 MG. Неактивированные тепловым шоком Т-клетки практически не атаковали опухолевые клетки. Зато двойной тепловой шок приводил к тому, что клетки практически полностью уничтожали опухолевый сфероид.

EchoBack-CAR T-клетки также можно активировать с помощью сфокусированного ультразвука, что и показали в исследованиях in vivo. Мышам, которым подкожно вводили клетки глиобластомы U-87 MG, также локально вводили EchoBack-hGD2CAR T-клетки. После двойной стимуляции сфокусированным ультразвуком (через 2 и 5 дней после введения Т-клеток) Т-клетки значительно подавляли рост опухоли и повышали выживаемость животных. При этом не наблюдалось признаков токсичности по отношению к печени, легким и почкам.

При лечении обычными CAR T-клетками глиобластомы, расположенной внутри черепа животных, рецидив наступал достаточно быстро — всего через 13 дней. Вместе с тем наблюдалась значительная системная токсичность. Однако в случае EchoBack-hGD2CAR Т-клеток токсичности не наблюдалось, а рост опухоли подавлялся в течение 17 дней. Выживаемость животных составила около 75%.

Транскриптомный анализ отдельных клеток (scRNA-seq) показал, что в EchoBack-hGD2CAR Т-клетках повышена экспрессия генов, связанных с цитотоксичностью, выживаемостью, пролиферацией и инфильтрацией. Вместе с этим снижалась экспрессия генов, ассоциированных с их истощением, по сравнению с обычными CAR Т-клетками.

Универсальность платформы EchoBack-CAR ученые доказали, разработав Т-клетки, нацеленные против PSMA — антигена, экспрессия которого повышена при раке простаты, но встречающегося также у здоровых почек, кишечника и мочевого пузыря. После стимуляции сфокусированным ультразвуком EchoBack-PSMACAR Т-клетки эффективно устраняли опухоли простаты in vivo. При этом значительно снижалась внеопухолевая токсичность. Это продемонстрировали в отдельном эксперименте, в котором мышам подсаживали две опухоли: проксимальную, в которой уровень экспрессии антигена был высоким, и дистальную, в которой уровень экспрессии антигена был на уровне здоровых тканей. Обычные CAR Т-клетки атаковали сначала проксимальную опухоль, но через 12 дней добирались и до дистальной, то есть они были реактивны и против опухоли, имитирующей здоровые ткани. Однако EchoBack-hGD2CAR Т-клетки устраняли только проксимальную опухоль, никак не влияя на дистальную, что, по мнению ученых, говорит о сниженной внеопухолевой токсичности.

CAR T-клетки могут вооружать другие Т-лимфоциты своими рецепторами