Флуоресцентные векторы на основе вируса бешенства использовали для картирования нейронных сетей

В последние годы для доставки молекулярных конструктов и препаратов в клетки мозга, а также для визуализации нейронных сетей стали использовать нейротропные вирусы. Группа ученых из Калифорнийского университета в Ирвайне (США) возглавила исследование по разработке панели векторов на основе вируса бешенства, которые позволяют визуализировать отдельные нейроны, синапсы, органеллы, а также нейронные сети.

За основу ученые взяли штамм SAD-B19 вируса бешенства, который используется в аттенуированной вакцине. Они удалили из вируса ген, кодирующий его гликопротеин (белок G), чтобы не дать вирусу распространяться сразу по нескольким синапсам в мозге. Все последующие конструкции содержали геном вируса бешенства с нокаутом по белку G — RVΔG, а для комплементации использовали аденоассоциированные вирусы с белком G.

На первом этапе ученые получили ряд векторов, экспрессировавших различные флуоресцентные белки, которые располагались в цитоплазме нейронов. В качестве флуоресцентных репортеров были выбраны белки: зеленый mNeonGreen, красный tdTomato, синий EBFP, бирюзовые mTurquoise2 и TFP1, а также дальнекрасный smURFP. Последний, как считают исследователи, может быть полезен в тех случаях, когда желательна низкая фототоксичность и небольшой фоновый сигнал. mNeonGreen и tdTomato были самыми яркими и стабильными из всех репортеров.

Исследователи также разработали конструкцию с белком-«таймером» — FT. Изначально такие белки дают синий сигнал, но со временем он меняется на красный. Они могут быть полезны для отслеживания доставки и распределения целевых белков, при этом флуоресцентные «таймеры» бывают как медленными, так и быстрыми.

В другую конструкцию ученые внесли люциферазу NLuc, сшитую с флуоресцентным белком tdTomato через саморазрезаемую связку. Люминесценция, производимая люциферазой, в некоторых случаях предпочтительнее флуоресценции из-за того, что не требует возбуждения внешними источниками. Так, конструкция с люциферазой может быть полезна для исследования светочувствительных систем. Еще одна конструкция, представленная исследователями, содержала ферритин — белок, связывающий железо и склонный к образованию мультимерных форм. Конструкты, содержащие ферритин и флуоресцентные белки, позволяют проводить исследования сразу несколькими методами — флуоресцентной микроскопией и электронной микроскопией, которая выявляет мультимеры ферритина благодаря их плотности.

Далее ученые получили ряд векторов на основе вируса бешенства, которые нацелены на конкретные компартменты клеток. Для этого они вносили в вектор последовательности сигналов локализации разных органелл либо специфические белки. Так, конструкция с белками mNeonGreen и PSD95 (находится преимущественно в постсинаптических нейронах) окрашивала в зеленый тела нейронов и дендриты, а позднее — дендритные шипики. Такой метод окраски оказался более эффективным и чувствительным по сравнению с анти-PSD95 антителами, которые используются обычно.

Другая конструкция, несущая белок dTomato с сигналами локализации митохондрий, окрашивала митохондрии нейронов в красный. При этом, в отличие от часто использующегося красителя для митохондрий MitoTracker, у такой конструкции был низкий фоновый сигнал. Кроме того, она подходила для экспериментов, требующих долгосрочного наблюдения. Аналогично ученые получили конструкции для окраски ядер, мембран, пресинаптических и соматодендритных структур.

Чтобы показать потенциал применения таких векторов в исследовательских целях, ученые использовали их для отслеживания различных изменений в микроструктурах мозга при старении и болезни Альцгеймера. В первом эксперименте они вводили молодым и старым мышам конструкцию RVΔG 2XMito-dTomato в основание гиппокампа, чтобы окрасить митохондрии в пирамидальных нейронах гиппокампа. В итоге исследователи выяснили, что у старых мышей митохондрии в пирамидальных нейронах в среднем на 20% меньше, чем у молодых. Во втором эксперименте ученые вводили конструкцию RVΔG PSD95-mNeonGreen, а также краситель для амилоидов AmyloGlo мышам 5xFAD, которые моделируют болезнь Альцгеймера. В результате они продемонстрировали амилоидные бляшки и потерю дендритных шипиков и синапсов в гиппокампе и коре.

Конструкты на основе вируса бешенства подходят и для визуализации in vivo. Так, ученые сделали вектор, экспрессирующий GCaMP7f — индикатор кальция. В результате они визуализировали ток кальция в клетках живых мышей с помощью двухфотонной микроскопии. Также конструкты оказались полезны в визуализации нейронных сетей с последующим автоматизированным подсчетом зараженных нейронов. Наконец, векторы, несущие несколько репортеров (например, флуоресцентный белок и ферритин), могут использоваться для мультимодальной визуализации с помощью коррелирующей 3D световой, рентгеновской и электронной микроскопии (CLXEM).

Дальнейшая цель ученых — снизить токсичность вируса бешенства, чтобы он мог использоваться в более долгосрочных экспериментах. Сейчас он обладает значительной цитотоксичностью, пик которой достигается через две недели после инфекции. Чтобы снизить этот эффект, ученым, вероятно, придется изменить или убрать некоторые вирусные гены.

Высвобождаемые маркеры позволяют отслеживать экспрессию генов головного мозга in vivo