Высвобождаемые маркеры позволяют отслеживать экспрессию генов головного мозга in vivo

Отслеживание экспрессии генов головного мозга очень важно для изучения его клеточной активности, понимания основ когнитивного поведения и контроля развития неврологических заболеваний. Однако сложная структура мозга препятствует прижизненному мониторингу. Сейчас для изучения экспрессии генов используют МРТ с генетически кодируемыми контрастными агентами, УЗИ с газовыми пузырьками, также кодируемыми в генах, оптоакустическую и флуоресцентную визуализацию. К сожалению, у всех этих методов есть недостатки. Американские ученые предложили новый способ неинвазивного мониторинга экспрессии генов.

Авторы создали высвобождаемые маркеры активности (RMA). При конструировании было важно, чтобы молекула смогла пройти и через клеточную мембрану нейрона, и через гематоэнцефалический барьер. Поэтому RMA приобрели вид молекул из двух доменов. Первый домен, помогающий пересечь мембрану, содержит люциферазу GLuc, которую можно детектировать биолюминесцентным имаджингом, и сигнал секреции. Для второго домена, необходимого для преодоления ГЭБ, ученые подобрали сразу три варианта: Fc-фрагменты человеческого мономерного IgG1 и мышиных IgG1 и IgG2a. Fc-фрагмент способен связываться с неонатальным Fc-рецептором, который экспрессируется в ГЭБ, и выходить в системный кровоток.

Для того чтобы проверить, может ли RMA проходить через ГЭБ, ученые вводили маркер в заднюю часть скорлупы полосатого тела мышей. Контрольным животным вводили либо только молекулу GLuc, либо молекулу RMA с мутациями в Fc-фрагменте, препятствующими к связыванию. Уже через два часа в плазме значительно повысился уровень полноценных RMA. Содержание GLuc и RMA с мутациями было намного ниже. За 24 часа количество RMA в плазме снизилось на 35±13%, а количество GLuc и RMA с мутациями упало на 96±2% и 53±17%, соответственно.

Затем мышам вводили аденоассоциированный вектор, кодирующий RMA и зеленый флуоресцентный белок (GFP). Вектор был нацелен на клетки мозга, экспрессирующие Cre-рекомбиназу. Если рекомбиназа присутствует в клетке, то она перевернет нуклеотидную последовательность в правильное положение и RMA с GFP будут экспрессироваться. На вторую и третью неделю авторы детектировали значительный биолюминесцентный сигнал в плазме крови. Инъекции в скорлупу, участок гиппокампа СА1 и черную субстанцию тоже привели к обнаружению RMA в плазме. Сигнал сохранялся в течение трех недель.

Низкие дозы вводимого вектора — 2,4×10⁶ и 2,4×10⁷ вирусных геномов — были достаточны для надежной детекции экспрессии генов. А самая высокая доза вводимого вектора — 2,4 × 10⁹ геномов — не вызывала гибель нейронов. RMA успешно детектировали экспрессию генов даже в небольшой популяции Th-положительных (экспрессирующих тирозингидроксилазу) нейронов.

На мышах ученые показали, что RMA в плазме крови отлично отражает состояние транскрипционной активности нейронов. Для опыта были выбраны модифицированные мускариновые рецепторы hM3Dq, которые активируются клозапином и вызывают сильное возбуждение нейронов с накоплением белка Fos. К 48 часу после активации сигнал от Fos-положительных клеток в плазме был почти в четыре раза выше, чем при инъекции буферного раствора.

Также авторы обнаружили, что RMA улучшает качество визуализации методом биолюминесцентного имаджинга за счет повышения интенсивности сигнала.

Таким образом, высвобождаемые маркеры активности — чувствительная, эффективная и неинвазивная система для прижизненного отслеживания экспрессии генов в головном мозге. Новая технология открывает большое количество возможностей для исследователей головного мозга.



Некоторые гены активируются в клетках мозга человека после смерти