Генетически кодируемые баркоды для пространственной электронной микроскопии

Ценным инструментом в анализе пространственных паттернов экспрессии генов служат генетически кодируемые флуоресцентные репортеры. Различные их варианты находят широкое применение в области флуоресцентной микроскопии, однако до настоящего момента практически не было создано их аналогов, применимых в электронно-микроскопических исследованиях. При этом электронная микроскопия (ЭМ) является общепринятым методом для исследований субклеточных структур и особенностей строения межклеточных контактов с (суб)нанометровым разрешением.

Контрастирование в ЭМ обычно достигается при помощи окраски тяжелыми металлами – с этой целью применяют тетраоксид осмия (OsO₄), уранилацетат и цитрат свинца. Генетически кодируемым методом контрастирования в таких случаях является применение ферментов, активность которых инициирует локальную полимеризацию 3,3′-диаминобензидина, с продуктом которой затем реагирует OsO₄. Потенциальное ограничение такого подхода — достаточно сложный протокол окрашивания и риск того, что контраст неравномерно распределится по целевым участкам. Недавно опубликованная в Nature Biotechnology работа посвящена новому подходу к решению этой проблемы.

Для контрастирования достаточно крупных (десятки нм) белковых комплексов, обладающих сложной геометрией, авторы статьи скомбинировали применение тяжелых металлов, флуоресцентных белков, инкапсулинов и жестких белковых спейсеров.

Инкапсулины — это семейство бактериальных белков, способных к формированию сферических белковых нанокомпартментов диаметром 25–30 нм, в которые затем могут загружаться различные другие белки. Встраивание в такие инкапсулиновые нанокомпартменты различных комбинаций металлсвязывающих мотивов и соединений позволило получить сферические концентрические баркоды для контрастирования субклеточных структур. Эту конструкцию назвали «ЭМкапсулины» (от EM – electron microscopy и encapsulin – инкапсулин).

В качестве агента, связывающего соединения тяжелых металлов, авторы использовали мышиный металлотионеин 3. Для этого белка показана способность связывать свинец, а отдельные участки иных металлотионеиновых доменов способны также взаимодействовать с уранил-ионами. Плюсом стал также малый размер белка. Это позволило напрямую сшить его с мономерами инкапсулина для улучшения контроля над стехиометрией и соотношением сигнал/шум. При помощи трансмиссионной электронной микроскопии авторы подтвердили, что на большом увеличении в таких конструкциях видны кольца контраста, расположенные там же, где и металлотионеин 3.

Дополнительные уровни ЭМ-контраста в таком подходе обеспечивались использованием нескольких копий металлотионеина 3 на внутренней поверхности ЭМкапсулинов. Всего таким образом было сконструировано шесть классов ЭМкапсулинов с различными типами белковых оболочек и различными радиальными профилями контраста.

Затем авторы объединили полученные ЭМкапсулины в различные паттерны, чтобы еще сильнее увеличить спектр доступных вариантов кодирования контрастируемых участков. Для этого они использовали жесткие белковые спейсеры различной длины. Основой для спейсеров послужил бактериальный белок SasG, имеющий нитевидную структуру, к которому пришили флуоресцентные белки sfGFP (superfolder GFP, вариант GFP с повышенной эффективностью фолдинга) и mCherry, каждый со своей стороны филамента. Вариативность длин линкеров достигалась вставкой различного числа доменов SasG, а связывание с самими ЭМкапсулинами обеспечивалось модификацией последних — в их поверхность встраивали антитела к этим флуоресцентным белкам. Такие линкеры коэкспрессировали с ЭМкапсулинами для получения различных паттернов контрастирования.

Пространственная локализация при этом обеспечивалась встраиванием в ЭМкапсулины тех или иных сигналов внутриклеточной локализации, а специфичность экспрессии конструкта в целевых клетках достигалась использованием соответствующего промотора.

Следующим шагом стало испытание разработки in vivo. С этой целью авторы получили трансгенных дрозофил, в нейронах которых экспрессировали ЭМкапсулиновые конструкты. Экспрессия различных их вариантов в разных типах нейронов позволила получить на ЭМ-снимках четкие пространственные паттерны, характеризующие гетерогенность популяций нейронов в мозге. Функциональность подхода также была проверена на мышиной модели – авторы успешно экспрессировали ЭМкапсулиновые метки в гиппокампе мыши, доставив конструкты при помощи вирусных векторов.

В дополнение ко всему авторы работы предлагают графический пользовательский интерфейс для обработки полученных ЭМ-изображений. Он позволяет автоматически классифицировать ЭМкапсулиновые метки с применением сверточной нейронной сети U-net.

Предложенный подход, таким образом, объединяет мультиплексное мечение исследуемых структур и разрешение снимков, доступное при помощи электронного микроскопа. Авторы публикации надеются, что их разработка станет ценным инструментом для пространственных ЭМ-исследований.

3D-видеонаблюдение в режиме реального времени фиксирует поведение вируса на ранней стадии инфекции