Генная терапия нормализовала состояние мышей с GTPBP3-опосредованным митохондриальным заболеванием

Митохондриальный геном (мтДНК) содержит два гена рРНК и 22 гена тРНК. Человеческие мт-тРНК проходят 18 типов посттранскрипционных модификаций, необходимых для приобретения ими правильной архитектуры. Неустойчивая позиция 34 чаще всего подвергается модификации. Две митохондриальные тРНК (тРНК^Leu(UUR) и тРНК^Trp) содержат 5-тауринометилуридин (τm⁵U), а три митохондриальные тРНК (тРНК^Glu, тРНК^Gln и тРНК^Lys) преимущественно содержат 5-тауринометил-2-тиоуридин (τm⁵s²U) в положении U34. Эти модификации вносят ферменты GTPBP3 и MTO1. Причем у человека GTPBP3 и MTO1 формируют комплекс.

Делеция гена MTO1 у рыбок данио, Caenorhabditis elegans и мышей приводит к гипомодификации тРНК, нарушает митохондриальную трансляцию, вызывая дефекты окислительного фосфорилирования и кардиомиопатию. Генетические мутации MTO1 у человека связаны с различными патологиями, включая гипертрофическую кардиомиопатию, лактатный ацидоз, оптическую нейропатию и когнитивные нарушения. Снижение уровня экспрессии GTPBP3 в клетках млекопитающих и в рыбках данио приводит к дефициту CI, дисфункции митохондрий и аномальному развитию клеток сердца.

В 30 семьях из восьми стран выявлено 35 генетических вариантов GTPBP3, приводящих к комбинированному дефициту окислительного фосфорилирования 23, аутосомно-рецессивному заболеванию с ранним началом, характеризующемуся гипертрофической кардиомиопатией, лактатным ацидозом и энцефалопатией. Эффект, который оказывают мутации GTPBP3 на тРНК-модификации, структуру и работу митохондрий, плохо изучен. Влияние, которое оказывают мутации GTPBP3 на организм, изучити исследователи из Китая.

Девочка в возрасте 13 месяцев поступила в отделение интенсивной терапии Детской больницы Чунцинского медицинского университета с лихорадкой, одышкой, цианозом, судорогами, нарушением сознания и снижением мышечного тонуса после острых инфекций верхних дыхательных путей. В больнице у нее были выявлены ацидоз, признаки нарушения энергетического обмена и повреждения миокарда.

В поисках причины был секвенирован экзом и митохондриальный геном пациентки. У нее были выявлены две миссенс-мутации в GTPBP3: c.689A>C (p.Q230P) унаследована от отца, а c.1120A>G (p.N374D) унаследована от матери. Вариант c.689A>C (p.Q230P) неоднократно упоминался в исследованиях, особенно в китайской популяции. Он является вероятно патогенным. Но вариант c.1120A>G (p.N374D) ранее не был описан.

Прекурсор GTPBP3 человека содержит 492 аминокислоты. Структура зрелого белка экспериментально не была определена. AlphaFold предсказывает, что у GTPBP3 три домена. Аминокислота Q230 не является консервативной. Q230 расположен в четвертой α-спирали HD-домена. Согласно предсказанной структуре GTPBP3, аминогруппа боковой цепи Q230 непосредственно взаимодействует с карбонильной группой основной цепи L445.

N374 — консервативный оcтаток G-домена. Структурный анализ показал, что аминогруппы и карбонильные группы боковых цепей остатка N374 непосредственно участвуют в распознавании GDP или GDP-AlFx (аналога GTP).

Авторы изучили ГТФазную активность мутантных GTPBP3. Белки экспрессировали в кишечной палочке. GTPBP3 выделялся обычно как димер, а мутанты GTPBP3-Q230P и GTPBP3-N374D — как мультимеры. Мутантные белки образуют агрегаты. Вторичные структуры мутантных белков претерпели существенные изменения — там было меньше α-спиралей и больше случайных петель. Взаимодействие между MTO1 и GTPBP3 усиливалось мутациями, в частности N374D. Экспериментальные данные позволяют предположить, что агрегаты расщепляются по убиквитин-протеасомному пути.

Авторы создали две линии клеток HEK293T, экспрессирующие GTPBP3-Q230P и GTPBP3-N374D, используя CRISPR-Cas9. Уровни мутантных белков были значительно ниже, чем белка дикого типа. Белка MTO1 тоже было меньше, как и митохондрий в целом. Клетки росли медленнее, особенно при наличии мутации N374D.

Уровни модификации τm⁵U34 в мтРНК^Leu(UUR) и мтРНК^Trp составляли 47,61% и 47,89% в клетках с мутацией Q230P и 9,23% и 3,56% в клетках с мутацией N374D по сравнению с клетками дикого типа. Количество белков MT-ND3 (субъединица CI), MT-ND6 (субъединица CI), MT-CO1 (субъединица CIV) и MT-ATP6 (субъединица CV) в обеих мутантных клеточных линиях было значительно ниже, чем в клетках дикого типа. Мутации не повлияли на экспрессию семи других белков. Метаболизм и работа митохондрий были нарушены.

Ни одна из этих мутаций не вызывала апоптоз клеток, но они влияли на митохондриальную морфологию. По-видимому, клетка вырабатывала больше митохондрий для компенсации нарушений в их работе. Также в мутантных клетках активировалась митофагия. Сигнальный путь mTOR был более активен в двух мутантных линиях, особенно в клетках с мутацией N374D. Ингибирование пути mTOR дополнительно меняло качество митохондрий и ускоряло удаление поврежденных митохондрий в двух мутантных линиях.

Авторы экспрессировали GTPBP3 в клеточной линии с мутацией N374D. Это восстановило способность клетки модифицировать РНК и нормализовало работу митохондрий, чего не происходило, если экспрессировать в клетках GTPBP3 с нарушенной каталитической функцией.

Q230 и N374 в человеческом белке GTPBP3 эквивалентны E230 и N374 в мышином Gtpbp3. Авторы получили клетки с мутациями E230P и N374D, а затем и мышей, гомозигот Gtpbp3-E230P (обозначены как E/E) и компаунд-гетерозигот Gtpbp3-E230P/N374D (обозначены как E/N). Гомозигот Gtpbp3-N374D получить не удалось, вероятно, они погибали на этапе эмбриона. Генотип E/N был похож не генотип пациентки.

Через 11–12 недель после рождения мутантные мыши весили меньше, чем мыши дикого типа, и эта разница возрастала со временем. Эти мыши жили меньше (36 недель для E/E и 25 недель для E/N), у них была нарушена работа сердца, скелетных мышц и митохондрий.

Ген, кодирующий Gtpbp3 дикого типа, поместили в аденоассоциированный вирусный вектор (rAAV9-Gtpbp3). Вектор вводили мышам E/N через 30 дней после рождения. У них восстанавливалась морфология и работа сердца. Модификация τm⁵U снова детектировалась в их клетках. Морфология митохондрий приходила в норму, как и клеточное дыхание.

Таким образом, авторы выявили две патогенные мутации в человеческом GTPBP3. Обе мутации вызывали локальные структурные изменения, мультимеризацию белка в растворе, агрегацию и убиквитин-опосредованную деградацию в клетках. Более того, обе мутации, особенно N374D, значительно нарушали трансляцию митохондриальных генов, структуру и функции митохондрий. Гомозиготная мутация N374D летальна еще во время эмбрионального развития, тогда как у гомозиготных мышей E/E или гетерозиготных мышей E/N развиваются кардиомиопатия и мышечная слабость. Авторы продемонстрировали на мышах, что опосредованная вирусом экзогенная экспрессия Gtpbp3 почти полностью обращает вспять митохондриальную, сердечную и мышечную дисфункцию, открывая новые перспективы для лечения митохондриальных заболеваний, связанных с GTPBP3.

Малая молекула для лечения митохондриальных заболеваний