Глухие игрунки помогут лечить наследственное заболевание человека

Ген OTOF кодирует белок отоферлин, необходимый для высвобождения нейромедиаторов внутренними волосковыми клетками. Потеря отоферлина ведет к глухоте, при этом структуры улитки остаются работоспособными. В таких случаях может помочь генная терапия. Действительно, разработанная на мышах генная терапия показала хорошие результаты в клинических испытаниях у детей. Но вопрос доклинической оптимизации такой терапии остается открытым. Для изучения эффективности, специфичности и длительности работы генной терапии лучше, чем мыши, подходят обезьяны. Немецкие ученые предложили в качестве модели использовать обыкновенных игрунок (Callithrix jacchus).

Игрунки хорошо подходят в качестве модельных животных для лечения глухоты. Они начинают слышать еще в утробе, как и люди, в отличие от мышей. Человеческий канонический белок отоферлин и длинная изоформа OTOF игрунки имеют длину 1997 аминокислотных остатков. Отоферлин состоит из тех же доменов, последовательности белков совпадают на 90%, причем в основных доменах белки еще более консервативны. Игрунки обладают некрупным размером, что позволяет проводить процедуры без седации или анестезии. Они приносят в среднем 2–3 детеныша дважды в год (период гестации 145 дней) в отличие, например, от макак (один детеныш каждые 1–2 года).

Животных с генетически обусловленной глухотой получали методом CRISPR с четырьмя гидРНК, таргетирующими 14-й экзон гена OTOF игрунки. Схожий подход применяли у мышей. Эффективность редактирования сначала подтвердили in vitro.

Для сбора ооцитов авторы провели 73 процедуры, в результате получили 1825 ооцитов. Они постарались насколько возможно снизить риск развития мозаицизма и нецелевого редактирования, так что вводили белки и РНК вместо ДНК-компонентов. Первой группе компоненты вводили до ЭКО, второй — после, третьей группе более высокую дозу компонентов вводили после ЭКО.

При введении CRISPR-компонентов до оплодотворения яйцеклетки эмбрионы развивались редко: из 98 ооцитов только 3 развились в эмбрионы, беременность не наступила. Тогда авторы переключились на редактирование генома после оплодотворения. Во второй группе из 515 ооцитов получили 166 зигот, а из них — 22 эмбриона. Подсадив их суррогатным матерям, получили 3 беременности, в результате которых родились три детеныша. Но делеции гена OTOF у них не было.

В третьей группе концентрации компонентов повысили. Из 993 ооцитов получили 374 предполагаемые зиготы, 56 эмбрионов, три беременности и четыре новорожденные игрунки. У двух животных были выявлены делеции целевого гена — длиной 192 п.о. и 227 п.о. у одной обезьяны и длиной 247 п.о. и 357 п.о. у второй без признаков мозаицизма. Следов нецелевого редактирования тоже отмечено не было.

К шести месяцам у модифицированных игрунок и у животных дикого типа не отличался вес. В этом же возрасте у всех детенышей измеряли ответы ствола мозга на слуховые раздражения и вызванную ото-акустическую эмиссию на частоте продукта искажения. Результаты в целом соответствовали картине, характерной для нокаута OTOF.

Если детенышей временно разлучали с семьей, те издавали несколько видов звуков, включая характерные только для детского возраста. Причем типы вокализаций модифицированных игрунок не отличались от звуков, издаваемых животными дикого типа, однако они были короче.

Во внутренних волосковых клетках игрунки с нокаутом OTOF отоферлин не детектировался. При этом плотность клеток не отличалась от контрольных.

В исследовании из 81 перенесенного эмбриона было получено всего два животных с нокаутом гена OTOF. Но с повышением активности CRISPR-системы выросла и эффективность процедуры. В дальнейшем планируется получить больше животных, используя оптимизированный протокол и путем скрещивания существующих игрунок с нокаутом гена OTOF с животными дикого типа.

Генная терапия восстановила слух у пяти пациентов с наследственной глухотой