Гуманизированные почки вырастили в эмбрионе свиньи

Возможности трансплантологии по-прежнему сильно ограничены из-за нехватки иммуносовместимых органов для пересадки. Один из путей решения этой проблемы — создание химерных органов, состоящих из клеток разных биологических видов. Для этого эмбрионы крупных млекопитающих дополняют, или комплементируют (англ. complementation) плюрипотентными стволовыми клетками человека. Эти клетки в процессе органогенеза должны занять «нишу», которую предварительно освобождают, остановив развитие собственных клеток животного с помощью генного редактирования.

Такой подход применили исследователи из Китая и Великобритании, статью которых опубликовал Cell Stem Cell. Им удалось значительно увеличить выживаемость человеческих стволовых клеток в эмбрионе свиньи и их способность дифференцироваться в зачаток почки (мезонефрос).

Свиньи давно привлекают внимание врачей-трансплантологов, поскольку больше других животных подходят для создания и хранения органов, которые затем пересаживают пациентам. Этой тематикой хирурги (например, В.П. Демихов) занимались еще в середине прошлого века. В наши дни понимание молекулярных механизмов иммунитета, тканевой совместимости, а также генное редактирование могут сделать ксенотрансплантацию реальностью.

Опыты по межвидовому органогенезу (развитию органа одного вида в организме другого) успешно проводят для пары мышь-крыса, однако с человеком и прочими крупными млекопитающими это затруднительно. Получению их межвидовых химер препятствуют, во-первых, конкуренция донорских клеток в бластоцисте и далее за клеточную нишу в ткани, и во-вторых, различия в стадиях развития у плюрипотентных стволовых клеток человека и клеток животного, которые нарушают синхронизацию эмбриогенеза.

Преодолеть такие затруднения можно с помощью активации в стволовых клетках регуляторных путей, которые повышают их выживаемость и подавляют апоптоз, связанный с клеточной конкуренцией.

Авторы нового исследования гиперэкспрессовали в человеческих плюрипотентных стволовых клетках (iPSC) два гена — MYCN и BCL2. Эта комбинация намного сильнее увеличила способность донорских клеток конкурировать с клетками хозяина (эмбриона мыши, кролика или свиньи), чем отдельные факторы.

Кроме того, ученые испытали новую культуральную среду 4CL для iPSC. Среда 4CL позволяет поэтапно «откатить» стволовые клетки на более ранние стадии развития, в менее дифференцированную форму. Важно отметить, что такая дедифференцировка не вызвала значительной геномной нестабильности.

Для эксперимента авторы выбрали почку — орган, пересадка которого требуется особенно часто. К тому же почка развивается на самых ранних стадиях эмбриогенеза. При этом она проходит фазы про-, мезо- и метанефроса. Формирование и деградация пронефроса и мезонефроса строго регулируются; за этими процессами следует внедрение в метанефральную мезенхиму зачатков мочеточника, с чего и начинается фаза метанефроса. Переходом управляют гены SIX1 и SALL1, поэтому авторы «выключили» их в свином эмбрионе с помощью генного редактирования CRISPR-Cas9; затем ядро соматической клетки перенесли в яйцеклетку. У таких эмбрионов было нарушено развитие их собственных почек, что освобождало клеточную нишу для человеческих клеток.

Авторы подтвердили, что новая среда 4CL лучше других подходит для культивирования iPSC. Секвенирование РНК отдельных клеток (scRNA-seq) выявило максимальное сходство транскриптома выращенных на 4CL клеток с клетками преимплантационной бластоцисты.

Самое интересное — конечно, создание и развитие химерного эмбриона. Оказалось, что лучше всего сработал протокол с введением 3–5 iPSC в морулу или раннюю бластоцисту свиньи. После этого зародыш следует перенести из чистой 4CL в среду, состоящую из равных объемов 4CL и среды зиготы свиньи (porcine zygote medium, PZM). В общей сложности исследователи пересадили 1820 эмбрионов 13 суррогатным матерям. Детально исследовали почки двух эмбрионов с нокаутами SIX1 и SALL1, извлеченных через 25 дней, и трех — через 28 дней. (Известно, что пик дегенерации эмбрионов приходится на срок около 1 месяца; на выбор времени отбора образцов «также повлияли этические соображения, касающиеся потенциального воздействия на другие ткани, включая мозг»)

Нормальное состояние введенных в эмбрион клеток подтвердили, оценив число двухцепочечных разрывов ДНК и апоптотических клеток (методом иммуноцитохимического окрашивания). Флуоресцентные метки (экспрессия белка DsRed) в iPSC указывали на, что многие из них встроились в мезонефрос (около 40-60% его клеточной популяции), а сам орган сохранил нормальную структуру. Не менее важно, что «мимо цели» — то есть в другие ткани, включая нервную — попали лишь отдельные клетки человека.

Хотя в исследованных зародышах метанефрос еще не сформировался, эксперименты показали принципиальную возможность успеха. Однако для этого необходимо повысить выживаемость эмбрионов на более поздних сроках. Даже эффективность клонировании нехимерных млекопитающих с переносом ядра соматической клетки пока еще остается низкой, подчеркивают авторы. Также пока неясно, как повлияют на пригодность эмбриона для трансплантации другие типы клеток в составе почек (например, клетки сосудов), если они будут принадлежать животному.

Организм человека более двух дней не отторгает почку свиньи с одним выключенным геном