Качество эмбрионов оценили по профилю внеклеточной РНК в культуральной среде

Эффективность процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) остается сравнительно невысокой — только 20–40% имплантаций заканчиваются рождением детей у женщин моложе 40 лет в США. Одна из трудностей заключается в оценке качества эмбрионов по другим критериям, кроме морфологических. Привлекательная альтернатива — неинвазивное измерение экспрессии генов в эмбрионах человека. Ученые из США проанализировали, можно ли оценить экспрессию эмбриональных генов по внеклеточной РНК, содержащейся в отработанной культуральной среде. Используя внеклеточную РНК, они определили гены, связанные с остановкой развития эмбриона, а также гены, специфичные для разных стадий эмбрионального развития. Кроме того, ученые предложили модель машинного обучения для определения качества эмбриона на основе профиля внеклеточной РНК. Результаты исследования были опубликованы в Cell Genomics.

Для проведения исследования были собраны образцы культуральных сред, использованных для культивирования ооцитов или выращивания эмбрионов. Образцы представляли собой отработанную питательную среду, которую собирали при замене культуральной среды. Было получено 295 образцов от 29 участников (доноров), включающие среды, собранные через 18, 68, 120 и 160 часов после осеменения (примерно соответствуют стадиям зиготы, 2–16-клеточной, морулы-бластоцисты и бластоцисты), а также среды, в которых культивировали неоплодотворенные ооциты. В качестве контроля использовали образцы чистой среды.

Все опытные и контрольные образцы анализировали с применением недавно разработанного метода SILVER-seq, который требует небольшого объема исходной среды. Вся ДНК, находящаяся в образце, удалялась с помощью ДНКазы, а также расщеплялись все белки. Далее синтезировалась и амплифицировалась ДНК, комплементарная внеклеточной РНК, находящейся в среде, для создания библиотеки секвенирования.

В результате из 295 образцов были получены 245 библиотек высокой концентрации, а из оставшихся 50 образцов — библиотеки средней концентрации. Отмечено, что выход ДНК в библиотеке коррелировал с количеством эмбрионов, культивированных в среде. Из чистых сред, использованных в качестве контрольных образцов, библиотеки не были получены, поскольку они не содержали РНК.

Ученые секвенировали библиотеки и получили по 5–6 миллионов пар прочтений на каждую библиотеку. Всего было обнаружено 6730 генов, примерно по 4000 генов — на каждом этапе развития эмбрионов (18, 68, 120, 160 часов).

Авторы сравнили результаты секвенирования с уже имеющимися наборами данных о внутриклеточной РНК, полученной на разных стадиях развития эмбриона методом scRNA-seq. Большинство обнаруженных генов внеклеточной РНК совпадали с генами, выделенными методом scRNA-seq, перекрытие составляло 66–83%. Следовательно, большая часть внеклеточной РНК, полученной из отработанной культуральной среды, соответствует внутриклеточной РНК в эмбрионах человека.

Среди полученного набора генов авторы выделили несколько временных траекторий, характеризующих стадии, на которых обнаруживались группы генов. Самый большой набор генов, названных «материнскими», включал 1293 гена, которые были обнаружены на стадиях от ооцита до 68 часов после осеменения и отсутствовали на стадиях от 120 до 160 часов. «Ооцитспецифические» гены были характерны только для ооцитов и отсутствовали в образцах, взятых в последующие периоды. «Ранние зиготические» гены выявлялись только в интервал с 18 до 68 часов, «поздние зиготические» — после 68 часов, а также была выделена группа генов, которые обнаруживались на этапе 120 или 160 часов. Кроме того, авторы определили 1265 генов, которые присутствовали на протяжении всех стадий.

Анализ генной онтологии показал, что перекрывающиеся гены в траекториях ооцитспецифичных и материнских генов были обогащены корегуляторами транскрипции и модификаторами гистонов, тогда как перекрывающиеся гены в траекториях поздней зиготы и посткомпактизации (120–160 часов) были обогащены компонентами мембраны, транспортных пузырьков и метаболическими процессами гликопротеинов и мембранных липидов.

Авторы исследования также изучили, есть ли связь между профилем внеклеточной РНК и остановкой развития эмбриона. Для этого сравнили данные 86 образцов, полученных из среды с живыми эмбрионами и 31 образец, взятый из среды, эмбрионы в которой прекратили развитие. В первой группе образцов концентрация библиотек была выше, чем во второй. Уровень 23 генов был выше в образцах, полученных от эмбрионов, которые перестали развиваться. Среди этих генов 10 были кодирующими, а остальные 13 — некодирующими. Наиболее значимыми генами оказались GPC3 и BRINP3, которые отрицательно регулируют клеточный цикл. Кроме этих генов, были также обнаружены BMP15, SLC25A26, TMEM164, ZMIZ1, PTBP2, DEAF1, MXI1, CABIN1, из которых три последних тоже отвечают за регуляцию клеточного цикла.

Наконец, авторы разработали и протестировали модель машинного обучения, направленную на определение качества эмбриона по профилю внеклеточной РНК. Для оценки эффективности модели использовали показатель AUC («площадь под кривой»), который оказался равным 0,90, что говорит об успешности данного метода. Модель, обученная на наборах данных, собранных со сред, в которых совместно культивировались группы эмбрионов, оказалась способной оценивать качество индивидуально культивированных эмбрионов.

Таким образом, данное исследование демонстрирует корреляцию качества эмбрионов для ЭКО и профиля внеклеточной РНК, полученной из культуральной среды. Основываясь на данных исследования, авторы предложили модель машинного обучения, позволяющую проводить неинвазивный скрининг для оценки качества эмбрионов.

Везикулы куриных желтков улучшают рост свиных эмбрионов