Китайские ученые разработали тест на коронавирус на основе CRISPR-Cas13a

Китайские ученые разработали быстрый тест на SARS-CoV-2, использующий систему CRISPR-Cas13a, и рассказали о нем в PLoS Pathogens.

Новый метод получил название CRISPR-COVID. Он предназначен для распознавания РНК нового коронавируса в клинических образцах. Принцип его работы заключается в следующем: таргетный участок генома SARS-CoV-2 в образце амплифицируется с помощью изотермической рекомбиназной полимеразной реакции; затем комплекс нуклеазы Cas13a с гидовой РНК распознает мишень; при взаимодействии нуклеазы с мишенью возникает флуоресцентный сигнал.

Для выбора оптимальной мишени ученые проанализировали образцы от 61 пациента с подозрением на COVID-19 с помощью высокопроизводительного метагеномного секвенирования (mNGS). Диагноз был подтвержден у 52 индивидов. Основываясь на полученных геномных данных, авторы идентифицировали наиболее консервативные участки — потенциальные мишени для разных вариантов SARS-CoV-2. Для выбора оптимальной мишени ученые провели скрининг праймеров и гидовых РНК, специфичных к этим участкам, и остановились на гене Orf1ab.

Аналитическую чувствительность CRISPR-COVID проверили на различных концентрациях РНК SARS-CoV-2, в 10 повторах для каждой концентрации. При концентрации 7,5 копий на реакцию мишень распознавалась в 10 повторах из 10, при 2,5 копиях на реакцию — в 6 повторах из 10, при 1,25 копиях на реакцию — в 2 повторах из 10. Специфичность подтвердили на панели микробных патогенов, среди которых были бактерии, вызывающие респираторные инфекции (S. pneumonia, H. influenza, M. pneumonia, C. pneumonia и B. pertusiss), человеческие простудные коронавирусы (H-Co-V-OC43, HCoV-NL63, HCoV-HKU1 и HCoV-229E) и вирусы гриппа А и B. Ни один из патогенов не дал ложноположительного результата.

Диагностический потенциал CRISPR-COVID оценивали на образцах РНК из клинического материала от 114 пациентов, из которых 61 был с подозрением на COVID-19 (у 52 из них диагноз подтвердился с помощью mNGS), 17 были SARS-CoV-2-отрицательными, но инфицированными простудным коронавирусом и 36 были здоровы. В качестве контроля использовали mNGS и ОТ-ПЦР.

CRISPR-COVID продемонстрировал чувствительность 100%, распознав все 52 SARS-CoV-2-положительных образца при отсутствии ложноположительных сигналов. ПЦР-тест выявил 90,4% пациентов с COVID-19. Авторы связывают пять ложноотрицательных результатов ПЦР-теста с низким титром вируса в клиническом материале. Ученые также отмечают скорость нового метода: анализ занимает около 40 минут (30 минут уходит на изотермическую амплификацию, 10 минут — на реакцию нуклеазы с мишенью). Для mNGS анализа требуется 20 часов.

Изотермическая амплификация не требует сложного оборудования, а потому CRISPR-COVID можно рассматривать как альтернативу ПЦР-тестам для лабораторий с ограниченными ресурсами. Стоимость одного теста составляет примерно $3,50. По оценкам ученых, при масштабировании тестирования эта цифра снизится до $0,7, что немного дороже, чем ПЦР-тест.

Ученые пока не запрашивали у регуляторных органов разрешение на клиническое использование CRISPR-COVID, однако они уверены, что у технологии большой потенциал. Авторы планирую интегрировать новую технологию в автоматизированную систему анализа, охватывающую и другие распространенные респираторные патогены.

Система CRISPR-Cas13a также используется в тестах на SARS-CoV-2 на платформе SHERLOCK. Тест-набор Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 одобрен FDA и сейчас проходит клинические исследования.