Квантовое секвенирование РНК одновременно выявляет m6A и 5mC модификации

Эпитранскриптом — это посттранскрипционные модификации РНК. Большая часть модификаций приходится на транспортные и рибосомальные РНК, но они также вносятся в матричные РНК и микроРНК, что влияет на структуру и функции молекул. Так, модификации m6A (N6-метиладенозин) и 5mC (5-метилцитозин) в микроРНК hsa-miR-200c-5p ассоциированы с прогрессированием и метастазированием колоректального рака.

Ученые из Японии разработали методику, которая позволяет определять N6-метиладенозин и 5-метилцитозин в одной и той же молекуле РНК. В основе методики лежит технология одномолекулярного квантового секвенирования, предложенная командой ранее.

Молекула нуклеиновой кислоты пропускается через отверстие диаметром 0,6–0,7 нм. При прохождении через отверстие формируется туннельный ток. Он детектируется парой золотых электродов, подведенных к наноотверстию. Само наноотверстие интегрировано в устройство размером 50х8 мм, состоящее из силиконовой подложки с полидиметилсилоксановым покрытием. Схема устройства представлена на иллюстрации.

Сначала ученые определили проводимость монорибонуклеотидов, в том числе метилированных. По этому показателю нуклеотиды выстроились в следующем порядке: 5mC (105 пСм) > rGMP (87 пСм) > m6A (92 пСм) > rAMP (67 пСм) > rCMP (60 пСм) > rUMP (36 пСм). Затем они использовали два варианта химически синтезированной микроРНК miR-200c-5p (5′-CGUCUUACCCAGCAGUGUUUGG-3′), у которой либо все нуклеотиды не были метилированы, либо были метилированы аденозин и цитозин, находящиеся в 7 и 13 положении соответственно. Сигнал для всех положений, в которых не были введены модификации нуклеотидов, для двух РНК совпадал и различался только для нуклеотидов в положении 7 и 13. После этого получили сигнал от всех нуклеотидов РНК, выделенной из образца клеток колоректального рака линии DLD-1. Средний уровень метилирования всех аденозинов составил 2,9%, цитозинов — 4,6%. Эти цифры соспоставимы с показателями, полученными ранее для другой клеточной линии, HCT116, с помощью масс-спектрометрии: 1,2% и 3,0% соответственно.

Далее авторы оценили уровень метилирования по каждому положению в отдельности. Он оказался наибольшим для положения 13 в случае цитозина (18,5% по отношению к неметилированному цитозину) и для положения 7 в случае аденозина (10,9%).

Метод позволяет определить присутствие двух модификаций в одной молекуле. Ученые показали, что цитозин 13 метилирован в 18,5% случаев, когда аденозин 7 неметилирован, и в 30,4% случаев, когда аденозин 7 метилирован. Похоже, что внесение одной модификации в микроРНК способствует внесению другой. Цитозин метилируется в том случае, если находится в пределах мотива, который узнает метилтрансфераза NSUN2. Основываясь на высокой гомологии NSUN2 с белками семейства YTHDF, связывающими m6A, авторы предположили, что NSUN2 также может связывать m6A и метилировать близлежащий цитозин. Однако это предположение требует проверки.

По мнению авторов, метод применим для комплексного анализа сайтов метилирования в эпитранскриптоме, что открывает новую эру в биологии РНК.