Малярийного плазмодия заставили экспрессировать лишь один вариант белка PfEMP1

В журнале eLife опубликован рецензируемый препринт статьи о новом методе изучения PfEMP1 малярийного плазмодия (Plasmodium falciparum). Данное исследование значительно расширяет возможности идентификации белков, задействованных в патогенезе малярии и механизмах уклонения паразита от иммунного ответа.

Белок PfEMP1 (Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1) играет ключевую роль в развитии тяжелой малярии. Он экспрессируется на поверхности эритроцитов, инфицированных малярийным плазмодием, и участвует в их цитоадгезии, то есть прикреплении к эндотелию кровеносных сосудов. Цитоадгезия — важнейший механизм выживания и распространения плазмодия, ассоциированный с тяжелыми симптомами болезни, включая церебральную малярию и плацентарную малярию у беременных. Удерживание на эндотелии позволяет его клеткам избегать фильтрации в селезенке, где они обычно уничтожаются, и продолжать размножение в кровотоке, заражая новые эритроциты. (Подробнее о цитоадгезии можно почитать здесь.)

PfEMP1 кодируется генами var, которых в геноме плазмодия от 45 до 90. Каждый паразит в определенный момент экспрессирует только один из этих генов, но может переключаться на другой. Этот процесс, известный как антигенная вариация, обеспечивает изменчивость поверхностных антигенов паразита и помогает ему избегать иммунного контроля хозяина.

Гетерогенная экспрессия генов var у паразитов в клеточных культурах приводит к образованию смешанных популяций клеток с различными антигенными и связывающими свойствами. Хотя ученые пытались отобрать штаммы с более стабильной экспрессией PfEMP1 или использовать антитела для их изучения, эта задача оказалась крайне сложной.

Авторы новой статьи использовали метод, называемый селекционно-связанной интеграцией (SLI). Принцип метода заключается в интеграции специальной плазмиды в геном паразита. Плазмида содержит участок гомологии с концевой последовательностью целевого гена var, участок, кодирующий эпитопную метку для белка, ген саморасщепляющегося пептида и ген устойчивости к антибиотику G418. При трансфекции такой плазмидой клетки паразита, которые экспрессируют целевой вариант PfEMP1 с эпитопной меткой, также обладают резистентностью к G418. После селекции на среде с G418 получаются плазмодии, которые экспрессируют только целевой PfEMP1, несущий удобную для исследований метку.

С помощью этого метода ученые модифицировали линию P. falciparum 3D7. После культивирования и отбора активация желаемых генов var подтверждалась ПЦР и РНК-секвенированием, также наблюдалась экспрессия белка. Однако инфицированные эритроциты не связывались или слабо связывались с рецептором CD36 на эндотелиальных клетках, хотя PfEMP1 присутствовал на клеточной поверхности.

Поэтому исследователи перенесли метод SLI на линиюP. falciparum IT4, который обладает повышенной способностью к цитоадгезии. В плазмодиях этой линии они активировали гены IT4var66 и IT4var2csa так же успешно, как и в случае линии 3D7. VAR2CSA – консервативный вариант PfEMP1, ответственный за связывание с рецептором клеток плаценты CSA (хондроитин сульфат А). Плазмодии, экспрессирующие этот белок, могут вызывать плацентарную малярию — накопление инфицированных эритроцитов в сосудах плаценты нарушает кровообращение и вызывает воспаление, создавая угрозу для здоровья как матери, так и плода.

Линия IT4 с активированным вариантом IT4var2csa продемонстрировала эффективное связывание с декорином и клетками эндотелия головного мозга человека (HBEC-5i), которые экспрессируют CSA. Добавление растворимого CSA ингибировало связывание, что открывает перспективы для разработки препаратов, предотвращающих развитие малярии беременных. В то же время эритроциты, инфицированные IT4var66, связывались только с клетками, экспрессирующими рецептор CD36, но не ICAM-1 (он считается кандидатом на роль рецептора адгезии хозяина при церебральной малярии) и не с контрольными клетками, экспрессирующими флуоресцентный белок GFP.

После этого авторы провели серию экспериментов, в которых показали, что транспорт PfEMP1 зависит от белкового комплекса PTEX.

Пвторы также представили усовершенствованную версию метода SLI — SLI2, которая позволяет вносить дополнительные изменения в геном паразитов, уже несущих модификацию SLI. С помощью SLI2 они получили плазмодиев, экспрессирующих PfEMP1, слитый с биотин-протеинлигазой BirA*, что позволило применять метод BioID для идентификации белков, взаимодействующих с PfEMP1. Это привело к созданию проксиома PfEMP1 — списка белков, которые находятся в непосредственной близости от PfEMP1 в живых паразитах.

В проксиом вошли многие известные участники транспорта PfEMP1, а также ранее неизвестные, такие как TryThrA и EMPIC3. Методом SLI2 исследователи нарушили функцию генов, кодирующих эти белки. Оказалось, что TryThrA и EMPIC3 необходимы для цитоадгезии, опосредованной PfEMP1. У паразитов с нарушенной функцией TryThrA наблюдалась аномальная локализация PfEMP1, в то время как паразиты с нарушенной функцией EMPIC3 сохраняли типичную локализацию PfEMP1.

Таким образом, SLI и SLI2 — мощные инструменты для изучения PfEMP1, которые позволяют достичь более глубокого понимания механизмов патогенеза малярии и разработать новые подходы к ее лечению и профилактике.

Резистентных к артемизинину возбудителей малярии выявили у детей с тяжелой формой заболевания