МД-2021, день 2: Биобезопасность
В рамках конференции «Молекулярная диагностика-2021» состоялся Российско-германский форум «Молекулярная диагностика и биобезопасность». Докладчики рассказали о быстрых технологиях, которые придут на смену ПЦР, о том, как устроен «электронный нос», способный различать по запаху стафилококк и клебсиеллу, о надзоре за гриппом и о том, как сделать ПЦР-тест сразу всем пассажирам самолета.
О возможностях и ограничениях молекулярной диагностики, выявленных пандемией COVID-19, еще раз напомнил Герман Шипулин (ФГБУ «ЦСП» ФМБА России). Пока нет вакцин, которые полностью предотвращают заражение и носительство, мы не можем отказаться от быстрой диагностики и противоэпидемических мероприятий. При грамотной организации эти мероприятия очень эффективны, что показал пример Китая. Раннее выявление случаев, изоляция и госпитализация, оперативное информирование контактных лиц, ответственность за нарушения противоэпидемиологических мероприятий плюс активная прививочная кампания — всё это азы эпидемиологии. Вопреки мнению, что «эпидемиология — русская наука», наша страна здесь существенно уступает Китаю.
Разные страны используют различные стратегии тестирования на COVID-19. Япония и Россия тестируют в первую очередь заболевших и контактных, анализируют кластеры случаев. Великобритания проводит тестирование в госпиталях, тюрьмах, домах престарелых, Германия, Италия активно тестируют прибывающих из-за рубежа. Самая эффективная стратегия — массовое тестирование (которое применяется опять-таки в Китае).
Охват тестированием до 75% не менее двух раз в неделю мог бы остановить распространение вируса. Но пока это недостижимый идеал для большинства регионов. Чтобы достичь его, необходимы быстрые методы — изотермическая амплификация нуклеиновых кислот, иммунохроматографический анализ (ИХА), экспресс-методы анализа летучих компонентов («электронный нос»). Важно охватить тестированием места, где собирается относительно немного людей, но они контактируют подолгу и нарушают масочный режим, — места работы и учебы, рестораны и кафе, больничные палаты.
Тесте для выявления коронавируса на основе LAMP разработан в ФМБА (подробнее на PCR.NEWS). Изначально была заявлена аналитическая чувствительность 5*103, сейчас удалось улучшить этот показатель и получить конкордантность с ПЦР 97,6% — это очень хороший результат. Также разрабатывается прибор для индивидуального пользования, размером чуть больше кружки — микролаборатория для амплификации ДНК, которую можно купить и поставить дома, как бытовой прибор. Существуют зарубежные разработки для самостоятельного тестирования — например, одобренный FDA для экстренного использования Lucira Check It на основе LAMP.
В настоящее время выбор российского пользователя для быстрого тестирования — антигенные тесты. Их активно внедряет Департамент здравоохранения Москвы, однако достоверность тестов сильно варьирует, о чем говорилось в первый день конференции.
Массовое тестирование в торговых центрах, аэропортах, стадионах невозможно провести никаким из перечисленных методов. Поэтому возникает концепция «электронного носа». Собаки обнаруживают инфицированных коронавирусом людей по запаху пота или слюны с поразительно высокой эффективностью — 94%. В воздухе, выдыхаемом человеком, содержится более 750 соединений, и количества как минимум 4-6 изменяются при коронавирусной инфекции. Уже опубликовано около десятка работ про электронный нос для COVID-19. В Сингапуре, США есть опыт практического применения. Прибор SpiroNose нидерландской компании Breathomix использовался на Евровидении для диагностики артистов и персонала.
В ФМБА разрабатывается «электронный нос» на основе прототипа, созданного в Институте синтетических полимеров РАН, где еще до пандемии предложили устройство, выявляющее испорченное мясо. Выдыхаемый воздух собирается в специальный пластиковый мешок, анализ в целом занимает около30 секунд. У такого прибора должна быть высокая чувствительность, сказал Герман Шипулин, требования к специфичности могут быть ниже — последующее тестирование с помощью молекулярных методов выявит ложноположительные результаты.
Обнаружение инфекций с помощью анализа выдыхаемого воздуха было темой доклада Дирка Кульмайера (Институт клеточной терапии и иммунологии общества Фраунгофера, Лейпциг, Германия). Над этой проблемой Кульмайер с коллегами начали работать около пяти лет назад, но «COVID-19 пришел слишком рано», «электронные носы» не успели разместить в аэропортах.
Существующие методы массового скрининга малоэффективны, отметил докладчик. Если больной примет жаропонижающее, с нормальной температурой его пропустят куда угодно. Молекулярные тесты еще недостаточно быстры. Поэтому все больше внимания привлекает идея анализа выдыхаемого воздуха и запаха тела. Всем известно «ацетоновое дыхание» при диабете. По-видимому, существуют летучие органические соединения (ЛОС), анализ которых позволит диагностировать вирусную инфекцию. Проблема в недостаточной специфичности ЛОС маркеров: на результат может повлиять, например, пища с луком и чесноком.
Тем не менее Дирк Кульмайер уверен, что такие приборы реально создать. Он рассказал об экспериментах по «неизвазивной диагностике» в Танзании, где гамбийские хомяковые крысы обнюхивают мокроту больных и детектируют туберкулез (такие же крысы умеют обнаруживать противопехотные мины, о них часто пишут в новостях). Но крысы не всем нравятся, «хотя я бы хотел погулять с крысой», сказал докладчик.
Прибор для диагностического определения ЛОС, созданный в Лейпциге, включает в себя спектрометр ионной подвижности и хроматографическую колонку. Цель разработчиков в том, чтобы сделать его маленьким, но прототипы уже стоят в ковидных клиниках. Образец дыхания собирается в течение трех секунд, и это всё, что требуется от пациента. Результат можно получить через несколько минут.
Для проверки концепции авторы определяли разные виды патогенных бактерий (кишечную палочку, стафилококк, клебсиеллу и др), в том числе лекарственно-устойчивых штаммов. Образцы выращивали в культуре 90 минут и анализировали воздух над культуральной жидкостью; результаты оказались обнадеживающими. Дирк Кульмайер сказал, что готовится в публикации работа по анализу дыхания пациентов с бактериальными инфекциями. Есть успехи и в различении дыхания больных гриппом и COVID-19.
Дарья Даниленко (НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, Санкт-Петербург) рассказала о сотрудничестве российских исследователей в системе Национальных центров по гриппу ВОЗ.
Глобальная система по надзору за гриппом впервые была создана в 1947 году: уже тогда было понятно, что вирус крайне изменчив, поэтому и вакцины надо регулярно изменять. Это начинание поддержала Всемирная организация здравоохранения и в 1952 году создала собственную систему по надзору за гриппом. Сегодня она объединяет 152 лаборатории в 130 странах. В Россию надзор за гриппом осуществляется на базе НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи в Москве и НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева (Федерального центра по гриппу и ОРЗ ) в Санкт-Петербурге (Национальный центр по гриппу).
Научные центры, включенные в систему надзора, собирают и анализируют эпидинформацию, составляют бюллетени и отчеты. Репрезентативные штаммы направляют в сотрудничающие центры (СЦ) ВОЗ. В сезоне 2019-2020 гг. РФ заняла третье место в Европейском регионе ВОЗ по числу штаммов, уступив только Англии и Германии, и второе по числу генетически охарактеризованных штаммов.
На смену традиционным методом надзора после пандемии свиного гриппа пришли молекулярные: определение линий, типов и подтипов, серология, секвенирование геномов, исследование устойчивости новых изолятов к противовирусным препаратам, разработка диагностических панелей. Благодаря этому российские исследователи были подготовлены к детекции SARS-CpV-2. В начале марта 2020 года в НИИ гриппа был секвенирован первый геном коронавируса.
Для своевременного получения стандартов для диагностики, новых штаммов и обмена информацией о вирусных геномах необходима международная кооперация. Национальный центр по гриппу много лет сотрудничает с глобальной научной инициативой GISAID, которая сейчас обеспечивает открытый доступ к геномным данным коронавируса, а изначально была создана для обмена данными по птичьему гриппу. В 2014 году в НИИ гриппа организовали тренинг для GISAID, а сейчас сотрудники института входят в состав команды, проверяющей качество депонированных данных.
Корнелиус Бартельс (Институт Роберта Коха, Берлин) занимается проблемами радиационной безопасности, но до того много лет работал в департаменте глобального здравоохранения и биобезопасности федерального агентства общественного здравоохранения Германии. Он начал доклад с перечисления основных биологических рисков и угроз. Это природные эпидемии, тропические болезни, намеренное распространение инфекции, биотерроризм и биопреступления (причем на нынешнем этапе нельзя исключать использования модифицированных патогенов), наконец, случайное распространение патогена (утечка из лаборатории), инфекции пищепродуктов и антибиотикорезистентность.
Попытки биотеррористических актов встречаются не часто, но помнить о них нужно, отметил Корнелиус Бартельс. Он рассказал о попытках производства ботулотоксина или чрезвычайно ядовитого белка рицина для бомб (последнее имело место в Кельне в 2018 году).
Чтобы оценить угрозу и наметить пути борьбы, нужен системный подход, подчеркнул докладчик. Необходимо использовать опыт прошлого, использовать методы, которые дают воспроизводимые результаты, адекватно оценивать зоны неопределенности и обеспечить равный доступ к информации.
Докладчик напомнил о случаях сибирской язвы 2009 года в нескольких странах Европы — патоген содержался в инъекционном героине. По аналогии с терактами в Нью-Йорке 2001 года было выдвинуто предположение, что и это теракты. Однако методично проведенное расследование позволило сформулировать другую версию: возбудитель мог попасть в наркотик непосредственно в «лабораториях» в Афганистане, где его производили.
До коронавируса наиболее опасными кризисными ситуациями были вспышки лихорадки Эбола в странах Африки. К высокой опасности патогена добавились отсутствие инфраструктуры во многих местах вспышек, санитарная безграмотность населения и социальные потрясения.
Для предотвращения новых угроз необходим систематический анализ рисков, включая пищевую безопасность и здоровье животных, а также тесные взаимодействия по этим вопросам между органами здравоохранением и службами биобезопасности, подчеркнул Корнелиус Бартельс.
Алексей Шабля из ГК «Южполиметалл-Холдинг» (ЮПХ) выступил как эксперт в области конструирования и производства автоматических средств выявления патогенов. ЮПХ производит аналитическое и диагностическое оборудование с 1993 года. В ее ассортименте — оборудование для рентгенофлуоресцентного анализа, спектрометрии ионной подвижности, ПЦР, раман спектрометрии, ИК-спектрометрии, проточной цитофлуориметрии.
Докладчик рассказал о комплексе для обнаружения физических и биологических угроз «Сегмент-Гамма». Он состоит из двух подсистем: «Сегмент Био» с помощью проточной цитофлуориметрии непрерывно анализирует воздух и неспецифично, но быстро определяет любые биоаэрозоли, содержащие бактерии, вирусы, грибки, токсины в концентрациях от 10-6 мг/л. Второй компонент, просто «Сегмент», — компактный спектрометр ионной подвижности, детектирует химическое оружие и токсичные вещества. «Сегмент-Гамма» уже установлен в Шеремеьево, «Сегмент» — в Московском метрополитене. Группа компаний сотрудничает по вопросам химической и биологической безопасности с Федеральной службой охраны РФ.
Алексей Шабля заметил, что решения по детекции химических и биологических агентов всегда стараются комплексировать. Но предыдущие доклады навели его на мысль о том, что биологические угрозы можно было выявлять с помощью той же спектрометрии ионной подвижности, и он выразил готовность повторить эксперименты немецких коллег.
Еще один интересный проект — быстродействующий портативный ПЦР-амплификатор «БиоЭксперт» в комплексе с устройством для сбора аэрозоля из воздуха «Тайфун-Сигма». Совместно с НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи и «Аэрофлотом» ЮПХ провела эксперимент по групповому бесконтактному тестированию на борту самолета. Стюардесса провозит по самолету «Тайфун-Сигма» на тележке, ненадолго останавливаясь у каждого кресла, за 20-30 минут, еще 10 минут уходит на подготовку жидкой пробы и 20 минут на ПЦР-анализ. Так можно выявлять любое заболевание, которое передается воздушно-капельным путем. По себестоимости такой ПЦР-тест эквивалентен одному анализу. Благодаря высокоэффективным воздушным фильтрам инфицированный пассажир опасен только для сидящих рядом — это человек восемь при рассадке 3-3 в эконом-классе, а в случае положительного результата пассажиров можно протестировать индивидуально после приземления.
«Мы все прекрасно знаем, что пандемия разнеслась по миру самолетами. Если бы такая технология распространилась массово, мы бы локализовывали очаги на уровне автомобильных переездов», — сказал Алексей Шабля.
Секцию завершил доклад Базеля Каро (Институт Роберта Коха, Германия) о Глобальной сети оповещения о вспышках заболеваний и ответных действий — GOARN. Глобальная сеть оповещения включает в себя многочисленные технические организации и учреждения общественного здравоохранения, лаборатории; в их число входит и Института Коха. Она работает в тесном сотрудничестве с ВОЗ. Основная задача GOARN — обеспечивать мультидисциплинарную техническую поддержку государств-членов во время эпидемии. Базель Каро рассказал, как организуется ответ на запрос от государства участника, как производится оценка риска и создаются обучающие программы, перечислил миссии по борьбе с COVID-19, в том числе в Таджикистане и Узбекистане.
Также Базель Каро представил слушателям инструмент Go.Data, разработанный ВОЗ в сотрудничестве с GOARN для отслеживания контактов инфекционных больных, и открытый для использования в любой стране, как в виде вебсайта, так и в виде мобильного приложения. Докладчик рассказал об опыте использования Go.Data в Намибии, которое началось в октябре 2020 года.
Информация о докладчиках
Герман Александрович Шипулин, зам генерального директора по научно-производственной деятельности ФГБУ «ЦСП» ФМБА России, руководитель Центра постгеномных технологий ЦСП ФМБА, Москва
Дирк Кульмайер, руководитель подразделения микродиагностики Института клеточной терапии и иммунологии общества Фраунгофера, Лейпциг, Германия
Дарья Михайловна Даниленко, к.б.н. ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, Санкт-Петербург
Корнелиус Бартельс, Институт Роберта Коха, Берлин, Германия
Алексей Олегович Шабля, группа компаний «Южполиметалл-Холдинг», Москва
Базель Каро, Институт Роберта Коха,Берлин, Германия