МД-2021, день 1. Молекулярная диагностика вирусных гепатитов

На секции «Молекулярная диагностика вирусных гепатитов», которая прошла в первый день X конференции «Молекулярная диагностика 2021», прозвучали сообщения о резистентности вируса гепатита C, алгоритмах тестирования населения на гепатиты B и C, расследовании случаев внутрибольничного заражения, эпидемиологии гепатита E и перспективах диагностики гепатитов.

Credit:
drmicrobe | 123rf.com

Секцию открыл доклад Федерико Гарсиа (Hospital Universitario San Cecilio, Испания) «Hepatitis C virus drug resistance: PROS and CONS for testing in clinical practice». Он рассказал о чувствительности разных генотипов гепатита C (HCV) к препаратам, ответе на лечение при использовании различных комбинаций и рекомендациях по определению устойчивости вируса. Так, в Европе не рекомендуется тестировать HCV на устойчивость до назначения терапии первой линии.

Гарсиа привел результаты исследования замен в геномах HCV, полученных от пациентов, которые не дали ответа на терапию ингибиторами неструктурного белка NS5A (стандартная антивирусная терапия прямого действия при гепатите C). Никаких «необычных» замен, ассоциированных с резистентностью, найдено не было. При повторное применение тройной терапии прямого действия (софосбувир/велпатасвир/воксилапревир) устойчивого вирусологического ответа через 12 недель достигли 94–100% пациентов.

По мнению Гарсиа, тестирование на резистентность не дает существенного вклада в подбор лечения. Генотипирование можно использовать лишь в том случае, если оно доступно и стандарты качества высоки. Лечение — лучший путь предотвращения трансмиссии HCV.

Следующим выступил Клаудио Галли (Abbott Laboratories, Италия) с докладом «Вирус гепатита С: лабораторная диагностика и каскад скринингов». Россия занимает пятое место по числу случаев гепатита C. Европейская ассоциация исследований печени (EASL) рекомендует использовать для выявления HCV тесты на антитела к вирусу и РНК либо антиген вируса в крови. Чувствительность существующих тест-систем на HCV варьирует от 95,1% до 98,1%.

Галли привел данные по сравнению чувствительности тестов на антиген HCV против тестов на РНК вируса. Он отметил, что при низких концентрациях вируса тесты дают дискордантные результаты. Порог концентрации вируса для антигенного теста составляет 1 000–3 000 копий вирусных геномов на мл.

Один из путей передачи гепатита C — употребление инъекционных наркотических средств. Галли отметил, что риск гепатита C высок даже для пациентов, которые употребляют неинъекционные наркотики. Он привел результаты тестирования двух популяций: с высоким и невысоким риском гепатита C. В первой популяции 29,7% индивидов получили положительный результат теста на антитела, 23,0% получили положительный результат тестов на РНК/антиген. Во второй популяции эти показатели были равны 5,8% и около 2% соответственно.

Галли привел сравнение четырех существующих стратегий скрининга на HCV. Он отметил, что внедрение скрининговых программ снижает затраты на одного пациента менее чем на 1%, но это приводит к снижению общих затрат на программу на 40%. По словам Галли наиболее эффективным алгоритмом тестирования на HCV является рефлекс-тестирование — использование одного образца для обоих анализов, необходимых для подтверждения диагноза.

Следующий спикер, Вера Кичатова (НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова), представила доклад «Биологическое значение мутаций в белке NS5A вируса гепатита C, ассоциированных с лекарственной резистентностью». Она отметила, что единицы процентов инфицированных получают противовирусную терапию за счет бюджета. Такой низкий показатель обусловлен недостаточной приверженностью пациентов лечению, а также недостаточным контролем эффективности лечения. Между тем примерно в 5% случаев препараты прямого противовирусного действия не работают. Чаще всего это связано с мутациями резистентности в геноме HCV.

Для терапии гепатита C применяются ингибиторы вирусных белков NS3 и NS5. На момент начала лечения вирус не имеет мутаций, обеспечивающих резистентность к ингибиторам NS3. Если в организме пациента существует квазивид (полиморфная популяция вируса), резистентный геновариант в процессе лечения замещает чувствительный, но припособленность его недостаточна, поэтому в конце концов он замещается обратно диким типом. С резистентностью к ингибиторам NS5 дело обстоит иначе: устойчивые к ним мутантные формы закрепляются в организме.

Кичатова рассказала об основных клинически значимых мутациях резистентности для трех генотипов HCV, наиболее распространенных в России: 1a, 1b и 3a. Замена M28V в NS5a, по мнению докладчицы, требует особого внимания, так как ассоциирована с резистентностью к ряду противовирусных препаратов. Эта замена встречается с частотой 57,9% в генотипе 1a. Замена C316N в NS5b снижает чувствительность к софосбувиру. Замена A30S в NS5a встречается в генотипе 3a с частотой 31%, но клиническая значимость ее неясна.

Затем Кичатова рассказала о ковариационных связях в геноме HCV. По ее мнению, мутации резистентности в NS5a приводят к изменению ковариационных профилей, что позволяет устойчивому геноварианту закрепиться в организме. Иммунологический анализ in silico показал, что замены в генотипе 1a приводят к снижению показателей иммуногенности эпитопов CD8. Возможность иммунологического бегства — еще одна причина распространения замен в NS5a.

После Веры Кичатовой выступил Николай Пименов (НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний) с докладом «Молекулярно-генетические подходы к анализу эпидемиологической связи случаев парентеральных вирусных гепатитов». Он рассказал о методах молекулярно-генетического расследования случаев гепатита, связанных с оказанием медицинской помощи.

В России ежегодно регистрируются случаи внутрибольничного инфицирования гепатитами B и C. Чтобы случай был признан внутрибольничным, он должен удовлетворять ряду критериев. Один из них — подтверждение эпидемиологической связи с помощью молекулярно-генетических методов. Для этого выбирается наиболее вариабельная область генома вируса. В случае HCB используются гены C и P, в случае HCV — гены NS5a, NS5b и гипервариабельная область на границе регионов E1 и E2. Алгоритм анализа включает шесть этапов, от сбора образцов до филогенетического анализа. Один из этапов — подбор группы сравнения. Она состоит из пациентов, инфицированных тем же генотипом вируса и проживающих в том же регионе, где произошло предположительное внутрибольничное заражение.

Пименов привел в пример три расследования. В двух случаях внутрибольничная инфекция не подтвердилась молекулярно-генетическими методами, хотя эпидемиологическая связь была налицо. Третий случай — заражение 12 детей гепатитом C в отделении онкогематологии одной из больниц ДФО. Расследование не только подтвердило внутрибольничную передачу инфекции, но также установило, что передача началась в 2000-х гг. Источником стал пациент с гепатитом C, неоднократно госпитализированный в эту больницу в период с 1996 по 2013 год.

Шахло Садирова (НИИ вирусологии Республики Узбекистан) представила доклад «Каскад скрининга вирусных гепатитов B и C при пилотной программе по элиминации гепатитов в г. Ташкенте, с последующей реализацией программы на уровне Республики Узбекистан».

Программа по элиминации гепатитов в Узбекистане UHEP проходит при поддержке фонда CDA. Пилотная программа была реализована в Ташкенте по следующему алгоритму: пациентов приглашали поучаствовать, согласившихся регистрировали, проводили им быстрые тесты на антитела к HCV и антиген HBsAg. На этом этапе отрицательные результаты были получены для 90% участников. Остальные 10% были направлены на более подробное обследование, в том числе им назначались тесты на ВИЧ и биохимический анализ крови. После этого назначалось лечение. За семь месяцев программа охватила 62 000 человек. В процессе происходила оптимизация. Так, часть процедур осуществлялась в поликлиниках по месту жительства. Там же наблюдались пациенты с легкими формами гепатитов. Более тяжелыми случаями занимался НИИ вирусологии. С пациентами, получившими положительные тесты, беседовали специально обученные медсестры, чтобы мотивировать их на дальнейшее обследование и лечение. Тем не менее, лишь треть HBV+ пациентов и четверть HCV+ пациентов дошли до стадии назначения терапии. Это говорит о необходимости разработки кампаний по осведомленности пациентов.

В целом пилотный проект показал хорошие результаты. В 2021 году он был запущен в тех регионах Узбекистана, где риск заражения гепатитами выше.

Для первичного тестирования использовали тесты на HBsAg компании Abbott, на антитела к HCV компании InTec. Подтверждение проводилось с помощью тест-систем «АмплиСенс» компании ИнтерЛабСервис.

Следующим выступил Карен Кюрегян (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумкова) с докладом «Молекулярная эпидемиология гепатита E». Гепатит E — это зоонозная инфекция. Известно семь генотипов вируса. Генотипы 1 и 2 циркулируют среди людей в бедных странах; генотипы 3 и 4 циркулируют среди животных и могут передаваться человеку. Пути передачи также зависят от генотипа. Так, для генотипов 1 и 2 характерен водный путь передачи, генотипы 3 и 4 передаются алиментарно и через воду. Последние два также могут перейти от человека к человеку парэнтеральным путем.

В Российской Федерации HEV циркулирует с 2013 года. Это генотип 3 из так называемой второй клады. Основным его резервуаром служат домашние свиньи. Они выделяют вирус с фекалиями в молодом возрасте. Считается, что к возрасту забоя происходит его полная элиминация.

Все современные штаммы HEV имеют предка родом из Китая. Капсидный белок вируса может содержать мутации, связанные с иммунологическим бегством. Современные штаммы HEV в России — результат завозов из Европы и длительной циркуляции вируса среди свиней. Автохтонные случаи гепатита E связаны именно с передачей вируса от свиней.

В этом году исполняется 40 лет открытию вируса гепатита E. Кюрегян анонсировал конференцию по вирусным гепатитам, которая пройдет 18–20 ноября 2021 года. Он обещал, что одна из секций будет целиком посвящена гепатиту E.

Завершил секцию доклад Владимира Чуланова (НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний) «Технологии CRISPR/Cas: перспективы применения в диагностике вирусных гепатитов».

Чуланов рассказал об истории открытия и использования системы CRISPR/Cas, отметив, что в 2020 году создатели метода геномного редактирования Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Дудна получили Нобелевскую премию. Докладчик отметил, что в настоящее время CRISPR/Cas применяется не только для редактирования генома, но и для диагностики инфекций. Он привел в пример платформы DETECTR, SHERLOCK и CARMEN, на базе которых разработаны инструменты для детекции SARS-CoV-2.

По мнению Чуланова, ПЦР — идеальный диагностический метод, однако в современных реалиях необходима более высокая скорость работы. Метод, основанные на CRISPR, работают быстрее, и в некоторых случаях они более чувствительные и специфичные. CRISPR-тесты можно выполнить в виде тест-полосок, что снимет необходимость в квалифицированном персонале в местах тестирования. С помощью CRISPR-систем можно будет не только выявлять нуклеиновые кислоты вирусов гепатита, но также генотипировать их. Кроме того, метод позволяет детектировать белки и другие соединения.

Чуланов отметил и ограничения метода. Так, результат зависит от качества образца; при постановке анализа может возникнуть проблема контаминации; необходимо упрощение и оптимизация условий.

В настоящее время ведется разработка методов детекции вирусов гепатита с помощью Cas-нуклеаз. Например, в 2020 году ученые из США продемонстрировали способность системы на основе Cas12a обнаруживать нуклеиновые кислоты HCV, а в 2021 году была опубликована работа китайской команды о применении Cas12a для детекции HBV.

Информация о докладчиках

Федерико Гарсиа, PhD, Hospital Universitario San Cecilio, Гранада, Испания.

Клаудио Галли, MD, PhD, директор глобальной медицинской службы Abbott Laboratories, Италия.

Вера Сергеевна Кичатова, к. м. н., ФГБНУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», ФГБОУ ДПО «РМАНПО» Минздрава России, Москва.

Николай Николаевич Пименов, к. м. н., ФГБНУ «НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» Минздрава России, Москва.

Шахло Сабировна Садирова, к. м. н., НИИ вирусологии Республики Узбекистан.

Карен Каренович Кюрегян, д. б. н., профессор ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАН, Москва.

Владимир Петрович Чуланов, д. м. н., профессор ФГБУ «НМИЦ фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний» Минздрава России, Москва.

Добавить в избранное

Вам будет интересно