МД-2021, день 2. Воздушно-капельные инфекции

Секцию открыл Марсель Мюллер (Институт вирусологии Шарите — Медицинский университет Берлина, Германия) докладом «От летучих мышей и верблюдов: экология и эпидемиология коронавируса MERS». Он рассказал о том, как развивалась диагностика «верблюжьего коронавируса» МЕRS и напомнил, что серологические тесты для него послужили прототипами для тестов на антитела к SARS-CoV-2. Например, применительно к MERS возникла идея использовать высококонсервативный нуклеокапсидный белок (N).

Современный алгоритм тестирования на антитела к коронавирусу — это мультиплексное исследование с помощью таких тестов, как SeraSpot немецкой компании Seramun Diagnostica. Например, их тест для исследования иммунного ответа на SARS-CoV-2 позволяет одновременно выявлять антитела к нуклеокапсиду, рецепторсвязывающему домену, домену S1 спайка и полноразмерному спайку. С помощью таких тестов можно отличить вакцинированных людей от переболевших.

Серологические исследования животных проводятся для изучения происхождения коронавирусов. У летучих мышей обнаруживаются и антитела против MERS, и вирусы, похожие на MERS, однако центральную роль в передаче человеку играли верблюды. MERS был выявлен в 2012 году, и выяснилось, что более 90% взрослых дромадеров на Ближнем Востоке и в Африке имеют антитела к нему, в отличие от других животных региона. Мюллер с коллегами показали, что, скорее всего, именно верблюды являются его естественными хозяевами и люди заражаются главным образом при контакте с ними. Дромадеров разводят в Африке и затем экспортируют на Аравийский полуостров. Антитела к MERS обнаруживаются даже в образцах африканских дромадеров 1983 года, так что, возможно, передача верблюдам от летучих мышей произошла именно в Африке. Активная инфекция чаще всего наблюдается у молодых животных. Видимо, когда верблюжонок теряет антитела, полученные от матери, он становится уязвимым к инфекции.

Марсель Мюллер рассказал о пяти циркулирующих линиях MERS. Линия 5, рекомбинант 3 и 4, практически вытеснила все остальные линии, что может указывать на ее пандемический потенциал.

Вакцины против MERS все еще нет, но возможно создание противовирусных лекарств. Коронавирус MERS, проникая в клетку, блокирует аутофагию, чтобы избежать разрушения. Никлозамид и другие стимуляторы аутофагии резко снижают скорость репликации вируса. Возможно, такой препарат будет эффективен и против других коронавирусов.

Пандемия пройдет, а респираторные патогены, в том числе и COVID, останутся, подчеркивает Николай Маянский (РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва). Поэтому свой доклад о возможностях и ограничениях молекулярной детекции респираторных патогенов он построил на примерах из доковидных времен. Насколько часто результаты тестирования влияют на ведение пациента, и в каких случаях его вообще нужно делать? (Если не говорить о COVID-19: при подозрении на него тестирование обязательно.)

Однако, например, до 80–90% респираторных заболеваний детей вызывается вирусами, нередко присутствуют 2-3 вируса одновременно. Отит, синусит, пневмония могут иметь и бактериальную природу, но и пневмококк, и другие бактерии могут быть как возбудителями болезни, так и комменсалами,то есть колонизировать дыхательные пути здоровых детей. У 35% детей выявлено бессимптомное носительство респираторных вирусов. Ожидаемо, у детей с внебольничной пневмонией вирусов больше, за исключением риновирусов, которые у здоровых детей выявляется чаще. По мнению ВОЗ, детям не требуется вирусологическое тестирование ни при отитах и синуситах, ни при ОРВИ; при пневмонии оно также редко назначается, так как у ребенка трудно получить мокроту.

Каким должен быть молекулярный тест на респираторное заболевание? По идее, быстрые тесты должны оказывать наибольшее влияние на исходы. Как показывают опросы, родители хотели бы получать результат за 20 минут. Мультиплексные тесты могут быть эффективными у детей. Взрослым можно рекомендовать более дешевое монотестирование, например, в период эпидемии гриппа, когда важно отличить грипп от всех остальных заболеваний. Однако иммунокомпрометированным пациентам лучше назначать широкое тестирование.

В любом случае положительный результат допускает разные интерпретации: выявление патогена, бессимптомное носительство, пресимптоматический период или остаточное выделение вируса после перенесенной инфекции. Интерпретацию затрудняет даже слишком высокая чувствительность — вероятность выделить живой вирус из положительных ПЦР-образцов тем ниже, чем ниже вирусная нагрузка по ПЦР.

Считается, что молекулярные тесты на лекарственную устойчивость должны оптимизировать применение антибиотиков. На практике все сложнее: когда тестировали всех пациентов с респираторными заболеваниями в отделении неотложной педиатрии и только в половине случаев сообщали результаты докторам, на назначения антибиотиков это никак не повлияло.

Докладчик отметил следующую закономерность: чем выше риск для больного, тем меньше влияет тест на решения врача, но чем меньше риск, тем меньшую добавочную значимость имеет тест. Для создания оптимальных алгоритмов тестирования необходимы дополнительные исследования.

Андрей Васин (Институт биомедицинских систем и биотехнологий СПбПУ, Санкт-Петербург) рассказал об альтернативе ПЦР-тестам — разработке мультиплексных тест-систем для определения прогностически значимых биомаркеров в сыворотке крови пациентов с ОРВИ.

Идея в том, чтобы найти биомаркеры, позволяющие различать вирусную и бактериальную инфекцию, отличать сепсис от местной инфекции, прогнозировать течение болезни и выбирать схему лечения. Известны сотни подобных маркеров — С-реактивный белок (СРБ), цитокины и пр. Но даже надежно отличать вирус от бактерий до сих пор не умеет, хотя известно, что вирусы и бактерии активируют различные клеточные паттерны, причем вирусы стимулируют выработку интерферонов, бактерии — СРБ. Недавно начали появляться работы о новом биомаркере респираторных инфекций — калпротектине.

Докладчик рассказал о х технологиях быстрого тестирования на различные маркеры, в том числе о своем многопараметрическом диагностическом комплексе «ТОРИ-тест», который, впрочем, «скорее поисковая работа, чем практическая». Так как все биомаркеры — белки, наряду с привычными методами можно использовать транскриптомику (например, мРНК белка IFI27 – маркер раннего периода COVID-19).

Новая разработка Андрея Васина с коллегами — мультиплексный анализ факторов воспаления в сыворотке крови методом количественной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Выявляют альфа-2 макроглобулин, фетуин А и сывороточный амилоид А, используют для этого синтетические пептиды, содержащие изотоп О-18. Метод проверили на двух выборках пациентов — с гриппом или тяжелым сепсисом , затем добавили еще пациентов с COVID-19. В качестве референса использовали стандартные методы ИФА. Анализ фетуина позволил дифференцировать сепсис от гриппа, но не грипп от коронавируса; сывороточный амилоид А не был информативным, но добавление в панель интерлейкина 10 повысило достоверность.

Елена Бурцева, руководитель лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва), рассказала о том, какую роль молекулярно-генетические методы играют в надзоре за циркуляцией вирусов гриппа. Она напомнила историю открытия вирусов гриппа и основные их особенности, важные для эпидемиологии (РНК-геном из 8 сегментов, который делает возможной реассортацию вирусов, 12 белков, в том числе поверхностные, определяющие подтип вируса — гемагглютинин HA и нейраминидаза NA). Основной природный резервуар гриппа — дикие птицы водного пространства Существуют отдельные линии вирусов гриппа человека, лошадей и свиней.

Сеть надзора за гриппом включает 148 центров в 120 странах, в том числе два российских. Изоляты из медучреждений, вирусологических лабораторий поступают в национальные центры, потом в сотрудничающие центры Всемирной организации здравоохранения. На основе полученных данных ВОЗ вырабатывает рекомендации, в частности, по составу вакцины.

Основные методы молекулярной диагностики, применяемые в надзоре за гриппом, — ПЦР, секвенирование, обратная генетика. Большое значение имеет определение доли вирусов гриппа в структуре циркулирующих возбудителей ОРВИ. Например, вирусы гриппа почти исчезли в после начала пандемии коронавируса, однако в этом сезоне уже регистрируется подтип H3N2.

Елена Бурцева рассказала, как был реконструирован вирус «испанского гриппа» H1N1 1918 года. В 2004 году Терренс Тампи провел реконструкцию, использовав образцы легочной ткани умерших от гриппа из вечной мерзлоты на Аляске, которые собрал в 1951 году Йохан Халтин. Реконструированный вирус продемонстрировал высокую патогенность на мышах. В дальнейшем удалось определить, с какими генетическими факторами связана его высокая патогенность и какие эволюционные события могли вызвать его появление. Испанка — «родитель всех последующих пандемий», подчеркнула докладчица; все пандемические вирусы благодаря реассортации наследовали от него свои внутренние белки.

Затем Елена Бурцева рассказала о детерминантах патогенности и вирулентности вируса гриппа 2009 года и о современных эпидемических штаммов 2020 года. Подтип H3N2 самый тяжелый для изучения, мутации в нем происходят крайне быстро. Особую тревогу вызывают мутации, ответственные за резистентность к противовирусным препаратам. Устойчивость к осельтамивиру и занамивиру создают мутации в нейраминидазе, к адамантану (Ремантадину) — М2, к новейшему препарату балоксавира марбоксилу (Ксофлюзе) — в РА. На сегодня у вирусов гриппа сохраняется чувствительность к первым двум препаратам, к адамантану устойчивы практически все. Но уже появились штаммы, устойчивые к Ксофлюзе.

Темой доклада Инны Эйдельштейн (НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленский государственный медицинский университет) была резистентность к макролидам у возбудителя пневмонии Mycoplasma pneumonia. Этот патоген вызывает вспышки в детских садах и других закрытых учреждениях.

Механизм устойчивости микоплазмы к макролидам хорошо изучен и связан с мутациями в определенном участке гена 23S рРНК. В НИИ антимикробной химиотерапии провели исследование устойчивости к макролидам у M. pneumonia. Для этого создали мультиплексную тест-систему на основе ПЦР-РВ с эффектом гашения флюоресценции зонда праймером, которая выявляет одновременно две мутации.

Во время подъема заболеваемости пневмонией в Смоленске все положительные результаты скринировали на мутации. Инна Эйдельштейн рассказала о случае внутрисемейного заражения устойчивым штаммом. Первым заболел пневмонией 17-летний юноша, у него выявили микоплазму и назначили азитромицин, но безрезультатно. Потом заразилась мать мальчика, ей сразу назначили фторхинолон, и повторный тест был отрицательным, мальчику фторхинолон тоже помог. Тест на чувствительность показал, что у мальчика сначала был штамм дикого типа, но потом приобрел мутацию, этим штаммам заразилась и мама. Исследователи наблюдали и другие примеры формирования резистентности в процессе лечения макролидами.

Докладчица порекомендовала всем исследование DeMaRes , где выкладываются данные по мутациям резистентности к макролидам и фторхинолонам у M. genitalium и M. pneumoniae . Там представлены образцы из 23 регионов РФ.. Самая распространенная мутация — замена А2058G, в некоторых образцах выявлено до трех различных маркеров. Можно видеть, что недавние подъемы уровня заболеваемости пневмонией, например, в республике Марий Эл, вызваны именно резистентентными штаммами. Болеют в основном дети, взрослые — чаще всего родственники и врачи скорой помощи.

О молекулярной диагностике внутрибольничной пневмонии рассказал Андрей Дехнич (Смоленский государственный медицинский университет). Нозокомиальная пневмония — это, по определению, пневмония, которая развилась после 48 ч пребывания в стационаре. Для докладчика, как фармаколога, молекулярная диагностика — способ выбрать антибиотикотерапию. Если 20 лет назад универсальные схемы лечения работали в 95% случаев, и в диагностике не было потребности, то теперь стандартные схемы «перекрывают» менее 40% случаев, и ожидания врачей от молекулярной диагностики растут. Врачи хотят знать этиологию (каким микроорганизмом инфицирован пациент) и резистентность к лекарствам, чтобы как можно раньше назначить терапию, а молекулярная диагностика дает существенный выигрыш во времени.

Андрей Дехнич тоже говорил о важности правильной интерпретации результатов анализа. Он привел в качестве примера случай, когда у пациента с множественными травмами на ИВЛ нашли акинетобактер с генами резистентности, устойчивость подтвердили посевом, однако никакой воспалительной реакции у пациента не наблюдалось, и терапию назначать не стали. Конечно, если бактериальная ДНК выявлена в локусах, которые в норме стерильны, лечение назначать необходимо, подчеркнул докладчик.

Преимущества молекулярной диагностики — выявление и характеристика трудно- и некультивируемых микроорганизмов, подтверждение механизмов устойчивости (например, к карбапенемам). Секвенирование дает много информации, не только об устойчивости, но и о маркерах вирулентности, однако пока оно мало применимо в рутинной практике.

Существует много российских ПЦР-тестов, которые позволяют выявлять основные гены резистентности и оценивать концентрацию патогена по числу пороговых циклов. Наибольшее количество решений дает панель BioFire FilmArray, которое включает десятки видов бактерий и вирусов, но она довольно дорогая.

В РФ молекулярно-генетические тесты для выявления карбапенемаз проводят 7,2% лабораторий, более половины не проводят никаких исследований. Пока ни одни рекомендации не регламентируют молекулярную диагностику при нозокомиальной пневмонии. Кроме того, нужны исследования по соотношению стоимости и эффективности. Быстрота на практике нивелируется долгой дорогой до лаборатории и очередью на тестирование, сказал докладчик. Единственная оправданная сфера применения молекулярных тестов в настоящее время — выявление важнейших генов устойчивости.

Тема доклада Дарьи Даниленко (НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России) интригует и врачей и пациентов: что происходит с вирусами гриппа и другими респираторными вирусами во время пандемии COVID-19, как поменялась их циркуляция и что нас ждет.

Теоретически должна существовать сезонность респираторных заболеваний. У гриппа она есть, у парагриппа и риновирусов менее выражена. В странах, где нет климатических сезонов, нет и «респираторной сезонности. В разных регионах может различаться порядок «волн»: например, в Японии все начинается с РСВ, а потом грипп, потом метапневмовирус.

До к COVID-19 у нас основной вклад в статистику респираторных заболеваний вносил грипп, и он был четко сезонным. В прошлом сезоне грипп был полностью вытеснен из циркуляции, отметила докладчица. Но сейчас мы видим рост — небольшой, однако похоже, что это только начало.

Рост наблюдается во всем в Европейском регионе ВОЗ. В Китае разворачивается практически полноценный эпидсезон. Интересно, что линия Ямагата гриппа В, в отличие от линии Виктория, не обнаруживалась с весны 2020 года. Будущее покажет, вымерла эта линия или нет.

Респираторно-синцитиальный вирус, особенно опасный для детей и пожилых людей, раньше приходил до гриппа. Зимой 2020-21 года он тоже был вытеснен, а теперь растет, и еще активнее, чем грипп. Во Франции прошла внесезонная эпидемия РСВ, в Исландии и Японии эпидемии были более интенсивными, чем в предыдущие сезоны. В Австралии не было гриппа в привычный эпидсезон, но РСВ был.

Метапневмовирус, «младший брат» РСВ, не был вытеснен из циркуляции, а даже вырос в сезон 2020-21, сейчас его активность невысока. Усиление наблюдалось и в Китае, а вот в США -нет.

Что касается других патогенов, включенных в систему надзора, показатели по парагриппу и риновирусам не изменились, другие коронавирусы человека, кроме SARS-CoV-2, продемонстрировали высокие показатели, аденовирусы и боковирусы снизились. При этом картина схожая среди госпитализированных и не госпитализированных людей, так что эти изменения трудно объяснить какими-то переменами в режиме тестирования.

Примечательно, что у детей с тяжелыми острыми респираторными инфекциями, помещенных в ОРИТ, выявляются разные патогены, а у взрослых это практически всегда COVID-19.

Таким образом, наибольшее беспокойство сейчас внушают грипп и РСВ. Очень важно вовремя диагностировать грипп, поскольку противогиппозные препараты эффективны только в первые 48 часов назначения. Нееобходима сочетанная диагностика COVID-19 и гриппа, отметила докладчица.

Информация о докладчиках

Марсель Мюллер, Институт вирусологии Шарите — Медицинский университет Берлина, Германия

Николай Андреевич Маянский, д.м.н., профессор, ФГАОУ ВО «РДКБ РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва

Андрей Владимирович Васин, д.б.н., Институт биомедицинских систем и биотехнологий Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого, Санкт-Петербург

Елена Ивановна Бурцева, д.м.н., профессор, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва

Инна Александровна Эйдельштейн, к.б.н., НИИ антимикробной химиотерапии ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России, Смоленск

Дехнич Андрей Владимирович, к.м.н., ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России, Смоленск

Дарья Михайловна Даниленко, к.б.н., ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России, Санкт-Петербург