МД-2023: Оценка качества НК на приборах Agilent. ДНК и РНК из парафиновых блоков, высокомолекулярные хвосты и нуклеосомные пики

erid:LdtCJyaQE

К.м.н. Александр Друй, заведующий лабораторией молекулярной онкологии в НМИЦ ДГОИ имени Д. Рогачева, заметил, что у многих капиллярный электрофорез ассоциируется в первую очередь с классикой — прибором Agilent 2100 Bioanalyzer. Однако прогресс не стоит на месте, и сегодня появились усовершенствованные модели. Большая часть данных, о которых говорил Александр Евгеньевич в докладе, была получена на приборе Agilent 4150 TapeStation (подробнее на PCR.NEWS). Лаборатория, которую он возглавляет, является национальным референс-центром и работает с образцами солидных опухолей у пациентов детского возраста. Образцы приходят в лабораторию со всей страны, так как определённые нозологические формы не могут быть идентифицированы иначе, как с применением молекулярно-генетических технологий.

Еще 10 лет назад работа с нуклеиновыми кислотами, выделенными из парафиновых блоков (FFPE), казалась невозможной задачей. Но сегодня, по словам Александра Евгеньевича, парафиновые блоки — это прекрасный материал, который позволяет в течение длительного времени без специфических условий сохранять любые виды нуклеиновых кислот для анализа. Этот материал может быть исследован с использованием большей части молекулярно-генетических технологий, в том числе — с помощью коротких прочтений ДНК и РНК. Исключением являются, пожалуй, только длинные прочтения с помощью Oxford Nanopore Technologies.

Для нуклеиновых кислот, выделенных из фиксированной ткани, характерны высокая степень фрагментации (длина фрагментов ДНК около 150 п.н., РНК – около 100 п.н.), химические модификации (образование ковалентных связей между цепями ДНК и сшивок ДНК-белок) и потеря пуриновых оснований. Причинами таких повреждений могут быть чрезмерная фиксация, несоблюдение объемов фиксатора и ткани, а также агрессивная декальцинация ткани.

Александр Евгеньевич подчеркнул, что количество данных, которое может быть получено из ткани, фиксированной парафином, огромно. Это не только определение однонуклеотидных вариантов или делеций и инсерций с помощью классического секвенирования ДНК, но и выявление структурных вариантов или аномального числа копий, с которыми работают на уровне РНК. Например, по рекомендациям Европейского общества медицинской онкологии (ESMO) клинически значимые структурные варианты в гене NTRK, сопровождающиеся образованием химерных конструкций, предпочтительно выявлять именно на уровне РНК, поскольку перестройка происходит в белоккодирующей области и тримерная структура онкопротеина сохраняется. Изучение мРНК позволяет перейти от анализа огромных количеств индивидуальных специфических для пациента перестроек, которые чаще всего происходят в интронах, к исследованию меньшего количества таких изменений уже на уровне объединения экзонов. Таким образом можно выявлять диагностически значимые перестройки или те, которые являются мишенями для проведения таргетной терапии.

Входной контроль качества такого сложного аналита, как РНК, очень важен, и для этой цели как раз и может быть использован капиллярный электрофорез. По словам Александра Евгеньевича, показатель RIN (RNA integrity number), который помогает оценить уровень целостности РНК, например, при проведении ПЦР-исследований, не совсем подходит для исследований в области молекулярной онкологии. При его расчете алгоритм использует в основном пики рибосомальной РНК, соответствующие малой и большой субъединицам рибосом. В то же время рРНК — это совсем не то, что интересует специалистов. Им важна в первую очередь мРНК или, реже, регуляторные РНК. Поэтому используют другой показатель, DV₂₀₀ — процентное соотношение фрагментов РНК с длиной больше 200 п.о. Согласно рекомендациям Illumina, качество выделенной РНК считается хорошим при значениях DV₂₀₀ более 70 %, то есть когда 70 % РНК в образце имеют длину более 200 п.о.

Рибосомальной РНК в клетке гораздо больше, чем мРНК, поэтому специалисты стремятся от нее избавиться. Для этого используют различные подходы, например, селекцию на основе полиА-повторов для нативной РНК. Однако в случае высокофрагментированной РНК, полученной из парафиновых блоков, о сохранности полиА-хвоста речи не идет, и проводят деплецию рРНК с помощью коммерческих наборов. Это позволяет сохранить показатель DV₂₀₀ на хорошем уровне.

Еще одной зоной применения капиллярного электрофореза при анализе нуклеиновых кислот Александр Друй назвал работу со свободно циркулирующей ДНК. Существуют специальные наборы для TapeStation, которые позволяют работать с низкими концентрациями сцДНК и анализировать ее фрагментный состав. Александр Евгеньевич показал на электрофореграмме таких образцов три пика.

Первый пик соответствует целевой фракции ДНК длиной 147–150 п.о. Такую длину имеют фрагменты, накрученные на нуклеосому, поскольку при образовании сцДНК, в частности, при апоптотической гибели клеток, разрывы происходят межнуклеосомно. Второй пик на электрофореграмме соответствует динуклеосомным фрагментам ДНК, а третий пик — примеси геномной ДНК, которую специалисты стараются минимизировать при проведении анализа. Для этого используются специальные консерванты, позволяющие сохранить внеклеточную ДНК и не допустить лизиса клеток.

В качестве примера Александр Евгеньевич привел сравнение профилей сцДНК, выделенной в его лаборатории из двух типов образцов — из ликвора и периферической крови — при опухолях головного мозга. При этом концентрация и качество сцДНК, полученной из люмбального ликвора, существенно ниже, а размер фрагментов меньше, чем у той, которую можно выделить из вентрикулярного ликвора.

В любой лаборатории, которая занимается секвенированием, капиллярный электрофорез служит полезным средством для контроля качества и оценки библиотек. Александр Евгеньевич привел примеры электрофореграмм успешно подготовленных библиотек, где получившиеся фрагменты порядка 300 п.н. имели достаточно маленькое распределение по длине. Зная такой параметр библиотеки, как длина в парах оснований, можно максимально корректно рассчитать ее молярность, чтобы затем пулировать и загрузить в секвенатор.

Не всегда качество библиотек получается таким хорошим, как специалистам хотелось бы. Чаще всего виной этому является неоптимальное качество ДНК на входе. В этом случае на электрофореграмме можно увидеть высокомолекулярную фракцию. Если её концентрация существенно ниже концентрации библиотеки, она не слишком помешает. Иногда получается достаточно большой «высокомолекулярный хвост», и тогда эти фрагменты не позволят точно рассчитать концентрацию библиотеки при загрузке в прибор. Еще один параметр, который позволяет выявить библиотеки неоптимального качества, — это димеры адаптеров, которые не должны превышать одну треть по высоте пика от пика библиотеки.

Электрофорез библиотек также помогает адаптировать условия анализа, в частности, подобрать оптимальное количество циклов секвенирования в зависимости от размера вставки — интересующего нас фрагмента ДНК, который находится между адаптерами. В случае амплификационных библиотек необходимо постараться избежать такого явления, как strand bias (прочтение только в одну сторону), и стремиться к тому, чтобы фрагменты размером 140-150 п.о. были максимально перекрыты прочтениями с двух сторон. Наиболее критичной такая ситуация становится тогда, когда регион интереса покрыт ампликонами стык в стык, без перекрытия. Для гибридизационных библиотек эта проблема не является такой актуальной, поскольку фрагменты распределены рандомно и имеют значительно большее перекрытие.

В завершение доклада Александр Евгеньевич отметил, что несмотря на существующие непростые условия, благодаря усилиям специалистов «СкайДжин» они с коллегами продолжают работать на приборах компании Agilent и использовать капиллярный электрофорез — как для контроля качества нуклеиновых кислот на начальных этапах анализа, так и для оценки качества библиотек.

Реклама. Рекламодатель ООО"СКАЙДЖИН". ИНН: 7705997147