Метод PANDORA-seq позволит изучать новые классы малых некодирующих РНК

Современные методы РНК-секвенирования, которые основаны на создании комплементарных ДНК-библиотек, не показывают истинную картину распределения малых некодирующих РНК. Это происходит в том числе потому, что модификации РНК мешают присоединению адаптеров и работе обратной транскриптазы. Особенно это актуально для таких высокомодифицированных РНК, как малые РНК, производные от транспортных РНК (tsRNA) и производные от рибосомных РНК (rsRNA).

Международная группа под руководством ученых из Калифорнийского университета в Риверсайде (США) разработала новый метод РНК-секвенирования — Panoramic RNA Display by Overcoming RNA Modification Aborted Sequencing, или PANDORA-seq. В его основе лежит обработка РНК ферментами, которые снимают с них модификации — T4 полинуклеотидкиназой (T4PNK) и α-кетоглутарат-зависимой гидролазой (AlkB). Протокол оптимизировали на РНК из тканей мыши и клеток HeLa: сначала отбирают фракцию РНК размером в 15–50 нуклеотидов, которую обрабатывают T4PNK, а затем AlkB.

Ученые проверили метод PANDORA-seq на разных тканях и клеточных линиях — мозге, печени, селезенке и сперме мыши, мышиных и человеческих эмбриональных стволовых клетках (mESC и hESC), HeLa, а также на мышиных эмбриональных фибробластах (MEF) в процессе перепрограммирования в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Для всех тканей и клеток продемонстрировали значительное увеличение уровня tsRNA и rsRNA, которые при традиционном РНК-секвенировании практически не распознаются, так как их «забивают» микроРНК. Для каждого биообъекта было характерно свое соотношение разных типов малых некодирующих РНК.

В нескольких тканях и клетках ученые показали, что профили микроРНК практически не изменяются при обработке ферментами, в то время как число разных rsRNA и tsRNA возрастает. Также были выявлены малые РНК, производные от Y-РНК (ysRNA), которые, как считается, вовлечены в иммунологические процессы и могут служить маркерами заболеваний, как и tsRNA с rsRNA.

Ученые проследили динамику изменения состава малых некодирующих РНК на примере MEF в процессе перепрограммирования в iPSC. Уровень микроРНК снижался, паттерны различных tsRNA и rsRNA также изменялись. Так, уровни 5′ tsRNA^Ala, 3′ tsRNA^Arg, 5′ tsRNA^Glu, 5′ tsRNA^His, 3′ tsRNA^Lys и rsRNA-28S-1 снижались в процессе дедифференцировки. Но в процессе дифференцировки mESC уровни тех же tsRNA и rsRNA возрастали.

Трансфекция rsRNA-28S-1 и tsRNA в mESC совместно и по отдельности ускоряла дифференцировку мышиного эмбриона, замедляя скорость трансляции отдельных матричных РНК.

Ученые сделали вывод, что метод PANDORA-seq можно успешно применять для изучения разных тканей и клеточных линий и для идентификации ранее неизвестных малых некодирующих РНК. В дальнейшем они планируют модифицировать метод, применив другие ферменты для снятия РНК-модификаций.