miSHERLOCK — CRISPR-система для диагностики коронавируса вне лаборатории

Ученые из Гарварда и MIT в сотрудничестве с бостонскими клиниками создали новую тест-систему для диагностики COVID-19 на основе CRISPR-Cas-платформы SHERLOCK. Эту платформу предложили в 2017 году пионер технологии CRISPR Фэн Чжан и Фрэнсис Коллинз из Института Бродов с коллегами. За время пандемии появилось несколько тестов на РНК нового коронавируса, которые используют SHERLOCK. Набор Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 получил разрешение FDA на экстренное использование в мае 2020 года, став первым разрешенным диагностическим набором на основе CRISPR.

Тесты для диагностики COVID-19 на основе технологии CRISPR-Cas предлагают и другие ученые (о китайской разработке на PCR.NEWS). Эти разработки позволили существенно сократить время до получения результата, но большинство из них могут выполняться только специалистами в лаборатории.

Новая система, названная miSHERLOCK (minimally instrumented SHERLOCK), представляет собой компактный прибор на батарейках с возможностью подключения к смартфону. Определение вируса занимает около часа и может выполняться в месте оказания медицинской помощи, при этом ни взятие пробы, ни проведение реакций не требует квалификации.

Диагностическая платформа состоит из двух термостатных модулей. В первом модуле находится воронка, в которую пациент помещает образец — 2 мл слюны. Слюна попадает на колонку, где нагревается до 95°С в присутствии DTT и EGTA; при этом инактивируются РНКазы, разрушаются вирусные частицы, высвобождая РНК, и слюна становится более жидкой. Вирусная РНК концентрируется на мембране внутри колонки.

Затем поршень перемещает мембрану в соседний модуль, где находятся запечатанные резервуары с водой и две реакционные камеры с лиофилизированными реагентами. В этом модуле происходит реакция SHERLOCK — обратная транскрипция, изотермическая амплификация и Cas-детекция в одном сосуде. (Две камеры нужны для дуплексной реакции, можно масштабировать платформу для трех и четырех реакций, которые будут идти одновременно.) Реакции протекают при температуре 37°С в течение 55 минут. Если в образце присутствует целевой участок РНК, фермент Cas12a расщепляет ДНК-зонды с флуоресцентной группой на одном конце и гасителем на другой. После этого флуоресценцию в реакционной камере, которая подсвечивается синими светодиодами, оценивают невооруженным глазом или измеряют с помощью специального приложения для смартфона.

В системе miSHERLOCK амплифицируются консервативный участок гена N-белка, специфичный для SARS-CoV-2 а также участки гена S-белка, кодирующие N-концевой и рецепторсвязывающий домены, которые содержат мутации, специфические для британского, бразильского и южноафриканского штаммов. Участок гена N-белка используется для универсального определения коронавирусной инфекции, участки гена S-белка — для определения штаммов, вызывающих опасения.

Платформа была разработана до широкого распространения штамма дельта SARS-CoV-2, но ученые говорят, что систему легко можно настроить и для его определения. По их мнению, miSHERLOCK хорошо подходит для мониторинга распространения новых штаммов.

Себестоимость прибора в настоящее время составляет 15 долларов, но, по мнению разработчиков, ее можно снизить до 2-3 $ при вводе в широкий оборот.

Другой метод быстрого выявления РНК (в том числе SARS-CoV-2) на основе CRISPR только что предложили постоянные соперники команды из MIT и Гарварда — сотрудники Дженнифер Дудны, которая вместе с Эммануэль Шарпантье получила Нобелевскую премию 2020 года за CRISPR-Cas-редактирование. Метод FIND-IT не требует предварительной амплификации и использует две неродственные CRISPR-нуклеазы — Cas13 и Csm6.