Митохондриальную ДНК единичных клеток 76-летней женщины анализировали новым методом
Исследователи из Китая и США разработали новый метод для анализа мутационной нагрузки митохондриальной ДНК (мтДНК) человека — секвенирование путем таргетной амплификации мультиплексных зондов (sequencing by targeted amplification of multiplex probes, STAMP), а также адаптировали его для работы с единичными клетками. Они секвенировали мтДНК 768 B-лимфоцитов и 768 моноцитов 76-летней женщины. Чаще всего встречались мутации в белок-кодирующих генах, большая часть этих замен была несинонимичной, а более 50% из них были, предположительно, высокопатогенными.
Митохондрия — единственная органелла животной клетки, которая имеет собственный геном. У человека этот геном представлен двухцепочечной молекулой ДНК (мтДНК) длиной 16,6 кб, которая кодирует 13 белков комплекса окислительного фосфорилирования, а также 22 тРНК и 2 рРНК. В каждой клетке находится множество копий мтДНК. Митохондриальная ДНК мутирует чаще, чем ядерная, что зачастую приводит к нарушению работы органеллы и даже к митохондриальным заболеваниям. Ученые предполагают, что мутации в мтДНК также участвуют в развитии ассоциированных со старением состояний, таких как диабет 2 типа, нейродегенеративные заболевания и многие виды рака.
Мутантная мтДНК обычно сосуществует с мтДНК дикого типа в клетке или ткани. Секвенирование популяции клеток может скрыть отдельные мутации в индивидуальных клетках. Поэтому так важно изучать единичные клетки при анализе мутаций мтДНК. Для этого существует несколько методов, у которых, однако есть свои недостатки. Исследователи из Китая и США разработали новый метод под названием секвенирование путем таргетной амплификации мультиплексных зондов (sequencing by targeted amplification of multiplex probes, STAMP). В новой работе они адаптировали его для работы с единичными клетками (single-cell STAMP, scSTAMP).
Метод STAMP использует 46 пар зондов (одноцепочечных олигонуклеотидов) для проведения реакции удлинения-лигирования по всей мтДНК. Продукт амплифицируют, полученную библиотеку очищают и секвенируют. Чтобы адаптировать метод для единичных клеток, авторы добавили этап амплификации до удлинения-лигирования.
Сначала метод опробовали на 24 B-лимфоцитах и 24 моноцитах, отобранных у 60-летнего донора. Среднее покрытие варьировало от 180× до 4489×. Учитывались мутации с частотой вариантного аллеля (VAF) более 20%. Всего авторы идентифицировали 27 мутаций. Эксперимент показал, что scSTAMP можно использовать для анализа мтДНК единичных клеток.
На следующем этапе исследователи проанализировали 768 B-лимфоцитов и 768 моноцитов 76-летней женщины. Среднее покрытие составило 744,03× и 640,16× соответственно. В дальнейший анализ вошли библиотеки с покрытием более 100×. Авторы идентифицировали 473 мутации с VAF более 20% в 416 сайтах в B-лимфоцитах и 505 мутаций в 439 сайтах в моноцитах. Каждый B-лимфоцит и каждый моноцит несли по 0,658 и 0,712 мутантных сайта соответственно. Чаще всего встречались замены G > A и T > C.
Среди изученных клеток 318 (50,3%) B-лимфоцитов и 346 (56,1%) моноцитов несли по крайней мере одну мутацию мтДНК (VAF более 20%). У B-лимфоцитов в среднем было 0,658 таких мутаций, а у моноцитов — 0,712. Более 20% мутаций имели VAF выше 90%. Чаще всего встречались мутации в белок-кодирующих генах, потом — в рРНК/тРНК-кодирующих генах. Большая часть замен в белок-кодирующих генах была несинонимичной, а более 50% из них были, предположительно, высокопатогенными.
Мутационная нагрузка в B-лимфоцитах от первого донора (около 60 лет) была ниже, чем у второго донора (76 лет), а мутационные нагрузки моноцитов были сравнимыми. Авторы говорят о том, что нужно систематически охарактеризовать мутации мтДНК единичных клеток во время здорового старения.
Источник:
Xiaoxian Guo, et al. High-frequency and functional mitochondrial DNA mutations at the single-cell level // PNAS (2022), 120 (1) e2201518120, published December 28, 2022, DOI: 10.1073/pnas.2201518120