Митомейоз — способ получения половых клеток из соматических

Ученые из Орегонского университета здравоохранения и науки под руководством Шухрата Миталипова применили к человеческим клеткам необычную технологию, которая позволяет получить из диплоидной соматической клетки гаплоидную яйцеклетку.

От бесплодия страдают миллионы людей в мире, и многие ее случаи связаны с отсутствием у пациента функциональных половых клеток (яйцеклеток или сперматозоидов). Так, у женщин старше 35 лет снижение количества и качества ооцитов становится одной из ведущих причин бесплодия. При этом снижается и вероятность успешного исхода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Методы получения половых клеток из соматических клеток (in vitro гаметогенез) активно исследуются. У мышей возможно получить ооциты и сперматозоиды из плюрипотентных половых клеток. Однако оогенез у человека — сложный и длительный процесс, который начинается еще во внутриутробном периоде; ооцит завершает свое развитие более чем за десять лет, к началу половой зрелости. Подобные сроки неприемлемы для клинического применения.

Функциональные ооциты могут также быть получены путем переноса генома соматической клетки в донорский ооцит (somatic cell nuclear transfer, SCNT). При этом собственные цитоплазматические факторы ооцита перепрограммируют соматический геном, поддерживают индукцию тотипотентности и развитие эмбриона после оплодотворения.

Перед овуляцией диплоидный первичный ооцит вступает в мейоз, который задерживается в метафазе II (MII) и завершается, когда происходит оплодотворение. Донорские ооциты, таким образом, находятся в MII, их цитоплазма сохраняет метафазную активность. Изначально применялись подходы, при которых SCNT-ооцит переходил к эмбриональному развитию без оплодотворения и завершения мейоза. Таким способом были получены клонированные млекопитающие, а также эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) из соматических.

Однако для лечения бесплодия нужны гаплоидные ооциты, подобные естественным, которые могут быть оплодотворены сперматозоидом. Исследователи из Орегонского университета здравоохранения и науки вместе с коллегами из Южной Кореи ранее провели уменьшение плоидности в мышином SCNT-ооците и после его оплодотворения и имплантации самкам-реципиентам получили живых мышей, которые сами дали потомство.

В новой работе Шухрат Миталипов с коллегами адаптировали эту процедуру для SCNT-ооцитов человека. Ооциты с диплоидным геномом соматической клетки проходили деление, которое авторы назвали «митомейоз», так как оно сочетает в себе черты митоза и мейоза.

           Естественный мейоз, митоз и митомейоз. PB — полярные тельца, в которых направляются «лишние» хромосомы в ходе оогенеза, чтобы получить гаплоидный пронуклеус ооцита; *n — число наборов хромосом, *c — число копий генома в клетке. Как и мейоз, митомейоз приводит к редукции плоидности (2n à 1n). Однако к полюсам веретена деления расходятся не сестринские хроматиды, а гомологичные хромосомы соматической клетки. При этом возможны сбои и появление клеток с аномальным количеством хромосом. Credit: Nat Commun (2025). DOI:  10.1038/s41467-025-63454-7 |  CC BY-NC-ND 4.0

В метафазе митоза и в метафазе II мейоза к полюсам клетки расходятся сестринские хроматиды, возникшие при репликации ДНК, — идентичные при митозе, идентичные за исключением участков кроссинговера при мейозе. Однако в метафазе SCNT-ооцита положение вдоль экватора занимают пары гомологичных хромосом, полученных индивидом от отца и от матери. Ранее авторы показали, что в клетках инбредных (генетически близких) мышей при этом довольно часто происходит правильная сегрегация хромосом — после деления образуются полные гаплоидные геномы.

Для исследования на человеческих клетках использовали ооциты здоровых доноров-добровольцев после обычной процедуры, применяемой в клинике. Из них удаляли веретено деления, затем проводили слияние энуклеированного ооцита с фибробластом кожи в фазе клеточного цикла G0/G1. При дальнейшем культивировании клеток в течение 1-2 часов в них появлялись веретена деления, как с нормальной, так и с аномальной морфологией.

Контрольные ооциты и SCNT-ооциты оплодотворяли сперматозоидами in vitro с помощью интрацитоплазматической инъекции (ИКСИ). Около 80% контрольных оплодотворенных ооцитов выделили полярное тельце и образовали женский и мужской пронуклеусы, однако лишь около четверти SCNT-ооцитов выделили полярное тельце, еще меньшее количество сформировало пронуклеусы, и эти процессы протекали существенно медленнее. Четверть их прошла деление, но остановилась на стадии двух клеток. Следовательно, естественной стимуляции входа в метафазу при оплодотворении SCNT-ооцита может быть недостаточно.

Остановка мейоза в ооцитах поддерживается высокой активностью фактора, способствующего созреванию (MPF), который включает в себя циклинзависимую протеинкиназу 1 (Cdk1) и циклин B. При оплодотворении ооцита изменение концентрации ионов кальция приводит к разрушению циклина B и инактивации Cdk1. Исследователи протестировали различные режимы инактивации MPF и подобрали оптимальный, который включал повышенный уровень Ca²⁺ в среде, электропорацию и инкубацию с росковитином, ингибитором Cdk1.

Когда 82 оплодотворенных SCNT-ооцита обработали таким образом, большая их часть стала выделять полярные тельца и проходить дальнейшие деления. Около 9% к шестому дню культивирования достигли стадии бластоцисты.

Авторы проверили, как происходит сегрегация соматических хромосом в SCNT-ооцитах при митомейозе, в дополнительном изящном эксперименте. К исследованию привлекли донора фибробластов — женщину, родители которой различались по этническому происхождению (что позволяло надежно отличать ее гомологичные хромосомы), и неродственного донора спермы. Это давало возможность определять происхождение гомологичных хромосом в зиготе с помощью секвенирования. Таким образом проанализировали 90 эмбрионов. Почти у половины все хромосомы оказались в пронуклеусе или в полярном тельце, у остальных паттерны сегрегации варьировали от 3:43 до 23:23. В среднем около 10 хромосом (максимум 16) разделились правильно, то есть одна из двух гомологичных хромосом попала в пронуклеус, другая в полярное тельце. Такая картина соответствует случайному распределению.

Тем не менее SCNT-зиготы могли проходить последующие митотические деления. В некоторых хромосомы SCNT-ооцита и сперматозоида интегрировались в единый геном, и все бластомеры демонстрировали один и тот же хромосомный набор, другие зиготы оказались мозаичными, с различным составом хромосом в бластомерах.

Каким образом можно повысить при митомейозе выход гаплоидных яйцеклеток с точной сегрегацией хромосом, мы спросили у руководителя работы Шухрата Миталипова, директора Центра клеточной и генной терапии эмбрионов Орегонского университета здравоохранения и науки.

— Мы уже пару лет работаем над этим, изучаем, как это происходит при природном мейозе. Главное требование, чтобы гомологичные хромосомы нашли друг друга и спарились по всей длине в профазе митомейоза. При природном мейозе это, видимо, достигается индукцией десятков запрограммированных двунитевых разрывов (double strand breaks, DBS) в одной из каждых гомологичных хромосом. Это привлекает комплексы репарации с участием гомологичной рекомбинации, которые и ищут, находят и спаривают гомологичные хромосомы. DSBs репарируются, при этом происходят кроссоверы, а дальше уже спаренные хромосомы входят в метафазу и потом расходятся после оплодотворения формируя галоидный геном. Мы будем модифицировать митомейоз и следовать по тому же механизму. Все очень просто.

Шухрат Миталипов: «Нужна эффективность редактирования не менее 90%»