Новое семейство антимикробных пептидов обнаружили у давно известной бактерии

Основным источником антибактериальных препаратов на протяжении последних 80 лет были природные соединения, вырабатываемые микроорганизмами. Обычно их выявляли, тестируя способность экстрактов того или иного продуцента подавлять рост бактерий, однако практичность такого подхода со временем снизилась из-за того, что зачастую соединения оказывались выделены повторно. На смену ему пришли высокопроизводительные скрининги синтетических соединений. Но и их успех оказался ограничен, а рост числа мультирезистентных патогенов продолжается до сих пор. Это привело к тому, что природным антимикробным веществам снова стали уделять много внимания. Авторы статьи в Nature повторно изучили Streptomyces rimosus — почвенную бактерию, выделяющую известный антибиотик окситетрациклин, — и показали, что она также продуцирует ранее неизвестный антибиотик с уникальным механизмом действия. 

Ученые проанализировали библиотеку из 255 штаммов бактерий (преимущественно почвенных актиномицетов). Метанольные экстракты фракционировали по полярности и направили на метаболомный анализ для исключения уже описанных соединений. Затем исследователи провели скрининг фракций с активными веществами, оценивая их способность ингибировать рост чувствительного к антибиотикам штамма Escherichia coli BW25113 ΔtolCΔbamB. По результатам скрининга они дополнительно фракционировали экстракт S. rimosus, очистили активные соединения и получили катионные циклические депсипептиды (пептиды со сложной эфирной связью), обладающие антимикробной активностью. Им дали название маникомицины (от слова manik, которое на языках хинди и панджаби означает «драгоценный камень»). Для дальнейшей характеризации авторы выбрали наиболее распространенный из них, маникомицин А (МКМ-А). 

Исследователи секвенировали геном S. rimosus, бактерии-продуцента маникомицинов, и обнаружили кластер биосинтетических генов, предположительно отвечающий за синтез этих соединений. Этот кластер, man, целиком клонировали в другой вид стрептомицетов, Streptomyces coelicolor. Полученный штамм обладал способностью секретировать маникомицины.

Затем авторы задались вопросом о механизме действия маникомицинов. Изначальное предположение о том, что они, подобно другим катионным антимикробным пептидам, пермеабилизуют мембрану бактерий, не подтвердилось. Тогда ученые стали искать внутриклеточную мишень — они культивировали E. coli BW25113 в присутствии субингибиторных концентраций МКМ. Таким способом они получили мутантов, устойчивых к маникомицинам, и секвенировали их геном. 

У резистентных E. coli исследователи выявили нонсенс-мутации в гене rpmI, кодирующем белок большой субъединицы рибосомы bL35. Это указало на рибосому как на возможную клеточную мишень маникомицинов. Чтобы подтвердить это, ученые отобрали устойчивых к МКМ мутантов в штамме, гиперчувствительном к антибиотикам, и проанализировали 23S рРНК в 11 случайных клонах. Они обнаружили делеции вблизи E-сайта большой субъединицы бактериальной рибосомы. Интересно, что этот участок никогда раньше не идентифицировали как сайт связывания антибактериальных соединений.

С помощью структурного анализа высокого разрешения авторы подтвердили, что маникомицины связываются с E-сайтом в большой субъединице бактериальной рибосомы. Оказалось, что при связывании МКМ препятствуют формированию промежуточного состояния рибосомы, и в итоге мешают транслокации. Ученые подтвердили это в опытах in vitro.  

Маникомицины избирательно подавляли рост грамотрицательных энтеробактерий (E. coli и K. pneumoniae) и микобактерий, но оказались неэффективны против многих других грамотрицательных и грамположительных бактерий, в том числе кишечных. Авторы предполагают, что причина в отсутствии подходящих транспортеров, из-за чего МКМ просто не проникали в клетки. 

S. rimosus, продуцент маникомицинов, защищаются от их токсичности за счет модификаций рРНК. Ученые выявили ген метилтрансферазы manE, которая вносит метку в 2′-ОН-группу одного из нуклеотидов 23S рРНК. 

Цитотоксичности по отношению к человеческим клеткам HEK293 и HepG2 ученые не обнаружили. Ex vivo модель инфекции — кровь, инокулированная K. pneumoniae, — показала, что за 6 часов воздействия пятикратной минимальной ингибирующей концентрации МКМ бактериальная нагрузка снижается примерно в тысячу раз. 

Попытки оценить эффективность маникомицинов на мышах оказались неуспешными из-за особенностей фармакокинетики. Тогда авторы смоделировали инфекцию на нематодах Caenorhabditis elegans, заражая их K. pneumoniae (в том числе мультирезистентным штаммом). В течение шести суток ученые обрабатывали инфицированных нематод маникомицином, полимиксином B или контрольным растворителем (ДМСО). При инфекции как референсным, так и устойчивым штаммом K. pneumoniae маникомицин улучшал выживаемость нематод до 55–60% (против 30% и 10% в соответствующих контрольных группах). Полимиксин обеспечивал сопоставимый эффект. 

Обнаруженные антимикробные пептиды — первые, по словам авторов, соединения, действующие на Е-сайт большой субъединицы рибосомы. Хотя фармакокинетические особенности ограничили тестирование самих маникомицинов in vivo, они могут стать перспективной основой для разработки принципиально новых антибиотиков. 

Новый класс антибиотиков подавляет транспорт липополисахаридов