Мутацию, вызывающую редкое неврологическое заболевание, исправили праймированным редактированием

Альтернирующая гемиплегия детского возраста (АГД) — редкое (1 случай на миллион человек) и неизлечимое заболевание, проявляющееся параличом, судорогами и нарушениями умственного развития. В 65% случаев его провоцируют мутации в гене ATP1A3, кодирующем субъединицу Na⁺/K⁺-АТФазы и крайне важном для работы мозга. Существующие методы генной терапии, такие как доставка здоровой копии ATP1A3 с помощью аденоассоциированных вирусов (AAV), пока не давали значимых улучшений в нервологических функциях и выживаемости, что обозначило необходимость в новых подходах к терапии. В то же время редактирование генома открывает многообещающие возможности повлиять на причину заболеваний. Некоторые методы — редактирование оснований и праймированное редактирование — позволяют точно модифицировать геном в клетках и живых организмах без использования двухцепочечных разрывов или донорных матриц ДНК. Исследователи из США предложили стратегии для исправления пяти самых распространенных мутаций ATP1A3 — D801N, E815K, L839P и G947R.

Первоначально ученые пробовали исправить мутации D801N, E815K, L839P и G947R с помощью редакторов оснований. Хотя редактирование работало, в случаях D801N, E815K и L839P возникали нежелательные побочные мутации в соседних нуклеотидах. Лишь G947R-A, вызванную заменой гуанина на аденин в положении 2839, удалось исправить точно и достаточно эффективно (до 40%) благодаря изолированному положению нуклеотида-мишени.

Из-за этих ограничений для остальных мутаций ученые перешли к праймированному редактированию — им было необходимо снизить риск нецелевых замен. Ученые оптимизировали конструкцию гидовой РНК (epegRNA) и добавили молчащие замены, которые позволяют избежать репарации ошибочно спаренных нуклеотидов. Это обеспечило исправление до 70% мутаций в клеточных моделях.

Далее редактирование проверили на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (иПСК), полученных от пациентов с АГД. Для мутации D801N точность коррекции составила 43% (при этом компонент системы репарации MLH1 подавляли с помощью мРНК MLH1dn), для E815K — 63%, L839P — 70%, G947R-C — 74%, G947R-A — 90%. Без подавления MLH1 эффективность была ниже, что указывает на важность уклонения от систем репарации.

Чтобы убедиться в безопасности метода, ученые провели анализ нецелевых изменений. Редактор оснований ABE8e (дезаминаза) вносил 16 нецелевых замен, все они находились в некодирующих областях. Праймированное редактирование показало еще лучшие результаты — всего 8 нецелевых замен с очень низким уровнем изменений (менее 0,5%).

Для мутации G947R-A авторы дополнительно протестировали модифицированные деаминазы ABE8e-V106W и ABE7.10, которые снизили количество нецелевых изменений до 15 и 0 соответственно. Это подтвердило, что метод можно сделать еще безопаснее.

Следующим шагом стала проверка метода на мышиных моделях АГД. Редакторы доставляли в мозг новорожденных мышей с помощью двойной AAV9-системы. Через 4 недели после инъекции в коре и гиппокампе 48-85% мутантных аллелей оказались исправлены у мышей с D801N, 27-46% — у мышей с E815K. При анализе только нейронов обнаруженная эффективность была еще выше — до 86-89%, что говорит о преимущественном редактировании в нейронах, связанном с тропизмом вектора AAV9 к этому типу клеток.

Важно, что активность Na⁺/K⁺-АТФазы, необходимая для работы нейронов, восстановилась до 87% от нормы у мышей с D801N и 77% у мышей с E815K. Также в плазме крови E815K-мышей снизился уровень легкой цепи нейрофиламента — маркера повреждения нервной системы.

Что особенно важно, при редактировании возросла выживаемость мышей. D801N-мыши без лечения погибали к 35-51 неделе, но после праймированного редактирования 56% самцов и 77% самок дожили до 52 недель. E815K-мыши с лечением показали 93% выживаемости у самцов и 92% у самок к 32 неделям против 46-50% в контроле. Кроме того, у животных уменьшилась тяжесть судорог и дистонии, улучшилась координация в ротарод-тестах, а также нормализовалась двигательная активность и исследовательское поведение.

Работа демонстрирует, что однократное праймированное редактирование может исправить множественные мутации, вызывающие тяжёлое неврологическое заболевание. Это важный шаг к лечению не только АГД, но и других генетических нарушений. Исследование открывает перспективы для клинического применения праймированного редактирования, предлагая точный и масштабируемый метод терапии ранее неизлечимых болезней. Следующий этап — адаптация технологии для применения на людях.

Редакторы оснований замедлили удлинение тринуклеотидных повторов при болезни Гентингтона и атаксии Фридрейха