Нанопоровое секвенирование анализирует одновременно метилирование ДНК и гистоновые модификации

Гистоновые модификации и ДНК-метилирование — тесно взаимосвязанные эпигенентические маркеры. Есть несколько общепринятых методов, которые позволяют изучать их, например, ChIP-seq, CUT&Tag, полногеномное бисульфитное секвенирование. Однако ни один из них не может анализировать ДНК-метилирование и модификации гистонов одновременно. В последние годы появлялись сообщения о разработке многообещающих методов, которые позволили бы одновременно изучать эти эпигенетические метки. Однако они зачастую полагаются на бисульфитную конвертацию, которая обладает рядом недостатков (ChIP-BS-seq, CUT&Tag-BS, scNOMe-seq).

В новой работе исследователи из Китая разработали метод nanoHiMe-seq (nanopore-sequencing-based Histone-modification and Methylome joint-profiling method) для одновременного анализа гистоновых модификаций и ДНК-метилирования. Он основан на нанопоровом секвенировании, которое позволяет идентифицировать метилированные цитозины (5-mC) в составе CpG и N6-метилдеоксиаденозины (6mA).

Сначала модифициорованные нуклеосомы, интересующие исследователей, связывают in situ с помощью специфичных первичных антител. Затем первичные антитела связываются вторичными антителами. Оба антитела притягивают к модифицированным нуклеосомам химерный белок, в состав которого входит белок A и фермент N6-аденинметилтрансфераза (pA-Hia5). Незакрепленные компоненты смываются, после чего pA-Hia5 активирую S-аденозилметионином (SAM). В результате аденины, находящиеся рядом с модифицированными нуклеосомами, метилируются. ДНК извлекают и подвергают нанопоровому секвенированию. Прочтения повторно анализируют с помощью скрытой марковской модели, которая выявляет 6mA и метилированные цитозины.

Перед разработкой своего метода авторы подтвердили, что pA-Hia5 обладает энзиматической активностью. После этого они обучили скрытую марковскую модель, а также сравнили ее с существующими программами для анализа метилирования, такими как Megalodon. Исследователи показали, что nanoHiMe-seq можно использовать как для анализа эухроматина, так и гетерохроматина.

Чтобы оценить работу нового метода, авторы профилировали гистоновые модификации H3K27me3 и H3K4me3 в клетках HepG2 и (или) GM12878, после чего сравнили результаты с данными, полученными методами CUT&Tag и ChIP-seq. Они выявили очень похожие профили. Анализ также подтвердил высокое разрешение нового метода. При этом нет необходимости в высоком покрытии. А большая длина прочтений позволяет оценить эпигенетические состояния различных аллелей.

Метод основан на работе антител, так что потенциально его можно адаптировать для любого эпитопа хроматина. По словам авторов, это простой, надежный и недорогой метод, который не требует амплификации. Потенциально он может идентифицировать и другие модификации нуклеотидов (5-hmC, 5-fC и 4-mC). Авторы планируют продолжить работу в этом направлении.

Нанопоровое секвенирование определяет разные типы метилирования бактериальной ДНК