Нацеленная на РНК нуклеаза Cas7-11 обладает минимальной цитотоксичностью

Американские ученые описали нуклеазу Cas7-11, которая таргетирует одноцепочечные РНК. В экспериментах на Escherichia coli она защитила клетки от бактериофагов и разрезала мРНК репортерного гена, снизив его экспрессию. В эукариотических клетках Cas7-11 также эффективна и в несколько раз менее токсична, чем Cas13. Каталитически неактивную Cas7-11 можно использовать для редактирования РНК.

Credit:
crocothery | 123rf.com

Существует не так много CRISPR-систем, которые таргетируют РНК. Одна из самых изученных включает в себя нуклеазу Cas13, которая токсична для многих типов клеток млекопитающих из-за нецелевой активности. Недавно идентифицировали CRISPR-систему подтипа III-E. Считается, что ее эффекторный белок — продукт слияния четырех субъединиц Cas7 и, предположительно, домена белка Cas11. Ученые из США назвали эту нуклеазу Cas7-11 и исследовали ее свойства. Они показали, что Cas7-11, как и Cas7, разрезает РНК, но при этом обладает минимальной токсичностью для эукариотических клеток.

В Escherichia coli экспрессировали белок Cas7-11 из бактерии Desulfonema ishimotonii (DiCas7-11). Используя библиотеку спейсеров, авторы показали, что нуклеаза помогает клеткам защититься от бактериофага MS2, чей генетический материал представлен одноцепочечной РНК. Также DiCas7-11 разрезала мРНК красного флуоресцентного белка; эффективность нокдауна составила 15–60%.

Авторы исследовали механизм действия DiCas7-11 in vitro. Они продемонстрировали, что нуклеаза разрезает РНК бактериофага в двух местах. DiCas7-11 таргетирует одноцепоченые РНК, но не двухцепочечные. DiCas7-11 также эффективно процессирует транскрипт пре-crRNA с образованием зрелой crRNA.

На человеческих и мышиных клеточных линиях авторы изучили работу нуклеазы DiCas7-11 в эукариотических клетках. Она эффективно производила нокдаун репортерных генов (люцифераз), а также эндогенных мРНК и длинных некодирующих РНК. Белок DiCas7-11 довольно большой, поэтому существуют определенные трудности в его упаковке в наиболее часто используемые векторы, например, аденоассоциированные вирусы. Также авторы получили каталитически неактивный белок dDiCas7-11 и использовали его для редактирования РНК в клеточной линии HEK293FT.

Ученые не обнаружили нуклеазной активности DiCas7-11 вне цели в бактериях или in vitro. Нуклеаза Cas13 убивает 30–50% эукариотических клеток, но DiCas7-11 обладает намного меньшей цитотоксичностью.

Cas7-11 относится к классу 1 CRISPR-систем, но при этом представляет из себя один белок. Он значительно отличается от раннее известных эффекторов, таргетирующих РНК. Авторы считают, что ортологи Cas7-11 можно широко использовать для воздействия на РНК благодаря отсутствию нецелевой активности и минимальной цитотоксичности.

Источник

Özcan A., et al. Programmable RNA targeting with the single-protein CRISPR effector Cas7-11 // Nature (2021), published September 06, 2021, DOI: 10.1038/s41586-021-03886-5

Добавить в избранное

Вам будет интересно