Не удалось получить кур, устойчивых к птичьему гриппу

Вирус гриппа A (IAV) заражает птиц и млекопитающих, вызывая респираторные заболевания и значительные экономические потери. Вирус птичьего гриппа несет в себе угрозу появления нового штамма, опасного для человека. В настоящее время в Азии, Европе, Африке и Америках распространился высокопатогенный вирус гриппа H5N1 2.3.4.4b, приводящий к гибели диких и домашних птиц и даже людей. Прививки не могут полностью защитить домашнюю птицу по многим причинам.

Для транскрипции и репликации IAV использует белки организма-хозяина семейства ANP32: ANP32A и ANP32B. ANP32A птиц и млекопитающих отличаются достаточно, чтобы ограничить заражение людей, контактирующих с больными птицами. Однако иногда вирус приобретает мутации, позволяющие ему пользоваться человеческими белками ANP32, что может привести к пандемии. У птиц ANP32B обычно неактивен, а ANP32E, скорее всего, обладает противовирусными функциями. Важнейшую роль в вирусной репликации несут аминокислоты 129N и 130D ANP32A. У ANP32B в этих сайтах находятся аминокислоты 129I и 130N. Британские ученые использовали геномное редактирование, чтобы изменить эти аминокислоты у ANP32A и создать кур, резистентных к вирусу гриппа.

Для получения клеток и кур ANP32A^N129I-D130N авторы использовали систему CRISPR-Cas9. Они изменили примордиальные зародышевые клетки самцов и самок и получили клональные клеточные линии. Наличие замен в обеих копиях генов подтвердили с помощью секвенирования по Сэнгеру. Нецелевого редактирования в предсказанных сайтах отмечено не было. Замены не повлияли на уровни экспрессии ANP32A и на транскриптом вообще.

Полученные клетки дифференцировали в клетки, напоминающие фибробласты, в которых может реплицироваться IAV. Полимеразы вирусов H9N2-UDL, H5N1 50-92 и H5N1 Tky05 работали в клетках дикого типа, но не в ANP32A^N129I-D130N или ANP32A^knockout.

Далее исследователи получили кур с заменами ANP32A^N129I-D130N. У них не было дефектов развития. У взрослых кур с мутациями не было изменений в росте, внешности, поведении или ответе на вакцинацию. Они также были фертильны.

Десять кур дикого типа и десять кур ANP32A^N129I-D130N заражали вирусом птичьего гриппа низкой патогенности H9N2-UDL (низкая доза). Все куры дикого типа заразились и могли передавать инфекцию дальше. Среди генномодифицированных кур заразилась только 1 из 10. У нее были низкие вирусные титры, и она не заражала других кур. У 5 кур ANP32A^N129I-D130N из 6 не произошла сероконверсия.

Далее кур заражали более высокой дозой вируса H9N2-UDL. Все куры дикого типа заразились и заражали других птиц дикого типа, но не кур ANP32A^N129I-D130N. Напротив, прямая инокуляция высокими дозами вируса заразила несколько кур ANP32A^N129I-D130N, и после этого они передали инфекцию некоторым курам дикого типа, но не генномодифицированным птицам. То есть модификации подавляли заражение, но не могли полностью предотвратить его при высоких вирусных титрах.

Секвенирование вирусных геномов показало, что вирусы, заражавшие генномодифицированных птиц, имели мутации в генах полимеразы (PA-E349K, PA-T639I или PB2-M631L, иногда в комбинации). Дальнейшие исследования подтвердили, что модифицированные клетки поддерживали активность этих мутантных полимераз. Про некоторые из этих мутаций раньше было известно, что они повышают активность вирусных полимераз. Более того, мутации PB2-M631L и PA-E349K позволяли им использовать человеческие ANP32A или ANP32B. Исследователи разобрали механизм, позволяющий мутантным полимеразам взаимодействовать с моддифицированным ANP32A птиц.

Далее опыты проводили на курах с нокаутом ANP32A. Внешность, поведение, анатомия и фертильность у них не отличалась от кур дикого типа. Вес у них был немного ниже. Тем не менее, даже таких кур мог заражать вирус птичьего гриппа.

Авторы предположили, что в этом случае вирус «приучается» использовать других членов семейства ANP32. Тогда они создали клетки с нокаутом ANP32A и ANP32B, ANP32A и ANP32E, а также всех трех ANP32 белков. Только тройной нокаут смог защитить клетки от вируса полностью. Авторы заключают, что изменения или делеции одного только белка ANP32 недостаточно для получения птиц, резистентных к птичьему гриппу. Необходимо изменить все три белка этого семейства.

Птичий грипп Северной Америки стал опасней в ходе эволюции