Нейронные сети помогают реконструировать структуру мозговой ткани

Для изучения функций мозга необходим инструмент in silico реконструкции структуры нервной ткани. Электронная микроскопия реконструирует мозговую архитектуру вплоть до отдельных синаптических связей, но ограничена статичными изображениями. В то же время световая микроскопия позволяет фиксировать динамические изменения, но не обладает достаточным разрешением. Статья, опубликованная в Nature Methods, представила новый метод, объединяющий световую микроскопию и машинное обучение для получения изображений нервных тканей с высоким разрешением.

Метод представляет собой модификацию STED-микроскопии — флуоресцентной микроскопии, которая дает разрешение сверх дифракционного предела за счет избирательного подавления флуоресценции. Исследователи оптимизировали параметры STED для повышения отношения сигнала к шуму (SNR), однако результаты оставались неудовлетворительными, и они прибегли к помощи машинного обучения. Нейронная сеть была обучена на наборе спаренных STED изображений с высокой и низкой выдержкой (выдержка в данном методе напрямую влияет на разрешение и четкость изображения). На тестовом наборе данных нейронная сеть успешно реконструировала изображения, снятые с низким разрешением, без потери клеточной структуры. Это позволило ученым проводить съемку множества изображений с малым разрешением и затем реконструировать структуры в высоком разрешении при помощи нейронной сети.

Следующий шаг анализа — сегментирование (аннотация) полученных изображений, то есть выделение в них объектов и областей. Этот процесс крайне трудоемок: на сегментацию 400 нм³ ткани подготовленному ученому требуется около 450 часов. Авторы создали еще одну нейронную сеть, натренированную на небольшом (для участка размером около 285 нм³) аннотированном наборе данных. Далее сеть реконструировала больший участок ткани, который, после внесения исправлений, был использован как дополнительный тренировочный сет с общим объемом тренировочных данных около 800 нм³. Компьютерная сегментация все еще требовала верификации человеком, но тем не менее такой подход значительно снизил затраты времени — весь процесс от съёмки до получения сегментированного изображения для фрагмента ткани размером 1737 нм³ (без учета верификации человеком) занимает меньше 45 минут. В «ручном режиме» этот же объем работы потребовал бы около 860 человеко-часов. Разработанный методологический комплекс авторы назвали LIONESS (live information-optimized nanoscopy enabling saturated segmentation).

 Реконструкция структуры органоида мозга человека: STED-микроскопия — обработка изображений (DL) — сегментирование (DL) — визуальный 3D-анализ. Credit: Johann Danzl |  Пресс-релиз

Эффективность протокола проверили на дендритных шипиках — эти структуры сложно аннотировать из-за крайне тонкой шейки, соединяющей шипик с дендритом. В качестве Однозначно идентифицировать все шипики, соединяющиеся с дендритом, можно с помощью флуоресцентных красителей, что дает объективный стандарт эффективности. Ученый, проводящий сегментацию в ручном режиме (без красителей), корректно идентифицировал 73±8,3% шипиков. Ученый, проводящий верификацию данных LIONESS, корректно идентифицировал 83±8,0% шипиков.

LIONESS также может использоваться в тандеме с другими методами. Так, его комбинация с флуоресцентными метками позволила идентифицировать на реконструированной структуре активные синаптические соединения. При этом соотнести флуоресцентную метку с конкретным синапсом удалось в 99,9% случаев, несмотря на значительно более низкое разрешение флуоресцентного изображения.

Низкая выдержка, используемая в LIONESS, дает возможность проводить серийную съемку и, как следствие, реконструировать структуру ткани в динамике. В тестах исследователи идентифицировали изменения структуры комплекса дендритов с мшистыми волокнами на промежутке в 19,5 часов.

Авторы также продемонстрировали, что LIONESS можно применять для курирования электрофизиологических экспериментов. При анализе двух нейронов, идентифицированных как связанные при помощи электрофизиологических методов, классическая световая микроскопия подтвердила их контакт, в то время как LIONESS выявила более сложную нейронную структуру, лежащую в основе связи.

Наконец, исследователи показали возможность реконструкции структур на больших объемах путем съемки перекрывающихся изображений. Для этого был реконструирован участок нескольких аксонов кумулятивной длиной примерно в 3мм.

Таким образом, LIONESS открывает новые возможности для нейробиологических исследований, позволяя реконструировать ткань мозга с недоступными ранее скоростью и качеством.

Флуоресцентная метка из ДНК с уникальным разрешением для микроскопии единичных молекул

Система AMATERAS позволяет рассмотреть миллион клеток на одном изображении