NICER — новый метод CRISPR-редактирования

Терапевтическое применение CRISPR-Cas осложняется нецелевым редактированием — ошибочным разрезанием других сайтов, кроме мишени, а также использованием путей репарации, оставляющим ошибки, — это негомологичное соединение концов (NHEJ) и соединение концов, опосредованное микрогомологией (MMEJ). При такой репарации вместо желаемой последовательности могут возникнуть не только небольшие инсерции и делеции (инделы), но и протяженные делеции, и даже обширные нарушения структуры хромосом. Поэтому продолжается разработка методов редактирования, более защищенных от ошибок.

Исследователи из Университета Осаки и других научных центров Японии предложили метод исправления гетерозиготных мутаций в клетке. Когда один аллель ассоциирован с болезнью, а другой нормальный (дикого типа), в качестве матрицы для редактирования первого можно использовать второй. Редактирование запускает никаза Cas9^D10A — вариант нуклеазы Cas9, который вместо двухцепочечных разрезов делает ники — разрезы в одной из двух цепей ДНК.

Никаза представляются привлекательным инструментом целевой репарации, минимизирующим нецелевые эффекты. Внесение ников в ДНК инициирует процессы исправления дефекта за счет соответствующей последовательности в гомологичной хромосоме. При этом может происходить рекомбинация, то есть обмен участками хромосом (этот путь тоже может смягчить симптомы заболевания, если две аллели с двумя разными мутациями преобразуются в один аллель дикого типа и один с двумя мутациями) или же репарация.

Ранее было показано, что внесение множественных ников в ген-мишень и в плазмиду, выполняющую роль матрицы для репарации, усиливает эффективность гомологичной рекомбинации по сравнению с единственным ником в последовательности-мишени. Авторы нового исследования предложили аналогичную стратегию, в которой матрицей для исправления мутации становится гомологичная хромосома с геном дикого типа. Они показали, что внесение множественных ников в обе хромосомы (включая один аллель-специфический ник в сайте мутации) позволяет исправлять гетерозиготные мутации в соматических клетках. Метод назвали NICER (multiple nicks induced by Cas9 nickase and a homologous chromosome as an endogenous repair template).

Для эксперимента взяли линию человеческих лимфобластных клеток TK6261, в которых оба аллеля гена тимидинкиназы 1 имели мутации (но в разных сайтах). Тимидинкиназа 1 (TK1) отвечает за биосинтез тимидинфосфата, ее активность можно отслеживать по способности клетки к пролиферации. Функция гена могла восстановиться тремя путями: за счет репарации по гомологичной хромосоме, обмена участками хромосом или делеции, восстанавливающей рамку считывания.

Авторы вводили в клетки с помощью электропорации мРНК никазы Cas9^D10A и гидовых РНК. Сначала использовали только специфически нацеленную на мутацию-мишень гидовую РНК (первичную), затем две гидовых РНК — первичную и нацеленную на близлежащий участок (вторичную). Во втором варианте количество TK1-положительных клеток выросло в 17 раз; секвенирование подтвердило присутствие в этих клетках присутствие гена дикого типа.

Затем авторы создали 67 дополнительных гидовых РНК, нацеленных на участок ±8.6 т.п.н. вокруг мутации-мишени и проверили каждую из них на способность повышать эффективность редактирования. Шесть лучших продуцировали положительные по активности TK1 клетки с эффективностью 3–4%. Комбинация двух из этих шести с первичной гидовой РНК позволила достигнуть эффективности 5–6%. Также авторы показали, что разрывы могут делаться как в смысловой, так и в антисмысловой нити. Важный момент: технология была эффективна, когда разрывы, инициированные вторичными гидовыми РНК, происходили в обоих аллелях. (Вторичные гидовые РНК, в отличие от первичной, распознают не только хромосому-реципиент с мутацией, но и матрицу, см. рисунок.)

Для дальнейших экспериментов брали клетки людей, имеющих комплексные гетерозиготные заболевания. Например, фибробласты кожи пациента с апластической анемией, умственной отсталостью и синдромом карликовости, содержали гетерозиготные мутации в гене алкогольдегидрогеназы 5 (ADH5) и гене альдегиддегидрогеназы 2; экспрессию ADH5 удалось восстановить с помощью NICER.

Также авторы убедились, что их метод может исправлять не только инделы и миссенс-мутации, но и обширные делеции размером до 600 пар нуклеотидов. Нецелевое редактирование было редким.

Интересно установить, какие клеточные механизмы задействованы в репарации множественных ников. Гомологичная репарация двухцепочечных разрывов обычно происходит на поздних фазах S и G2 клеточного цикла (синтез и рост), репарация ников — по-видимому, даже в фазе G1 (подготовка к митозу). Образование ников приводит к обнажению одноцепочечной ДНК на обширном участке вокруг целевого сайта; эффективность процесса снижают нокдауны BRCA1 или BRCA2, нокаут EXO1; для редактирования необходим RAD51 (белок, играющий ключевую роль в рекомбинационной репарации). Однако детали процесса пока остаются неясными.

Результаты редактирования генов эмбриона нужно точнее контролировать