Новые большие сериновые рекомбиназы намного эффективнее ранее известных

Манипуляции с эукариотическим геномом, особенно вставка больших последовательностей ДНК, сопряжены с определенными трудностями. В настоящее время ученые часто полагаются на гомологичную рекомбинацию, которую направляют, внося в ДНК двуцепочечные разрывы. Однако у этого метода есть ограничения, такие как низкая эффективность вставки, особенно больших фрагментов. К тому же метод не работает на неделящихся клетках, а внесение двуцепочечных разрывов сопряжено с определенными рисками.

Чтобы преодолеть эти ограничения, используют системы интеграции фагов и бактерий, такие как сайт-специфическая рекомбинация. В природе эти механизмы появились, чтобы таргетно вставлять большие фрагменты ДНК фага, не полагаясь на собственные факторы клетки. Привлекательная идея — использовать их для целей генной инженерии. И действительно, уже сейчас в практике применяют большие сериновые рекомбиназы (LSR), такие как Bxb1 и PhiC31. В отличие от тирозиновых рекомбиназ, они работают только на вставку фрагментов ДНК. При этом размер этих фрагментов может быть очень большим. Однако эффективность вставки не очень велика.

Ведутся исследования для улучшения известных LSR, однако в новой работе ученые из США пошли другим путем. Они систематически искали LSR в мобильных генетических элементах бактериальных геномов с помощью вычислительных методов, а затем экспериментально охарактеризовали эффективность своих находок. Лучшие из найденных LSR намного превосходят все известные сериновые рекомбиназы.

При сайт-специфической рекомбинации сайт attP мобильного генетического элемента связывается с сайтом attB бактериального генома. После вставки формируются сайты attL и attR. Авторы анализировали последовательности LSR и эти сайты в геномах 194 585 бактериальных изолятов. Сначала ученые идентифицировали 12 638 кандидатов и в итоге получили 6 207 последовательностей уникальных LSR и их сайтов интеграции.

Сначала из всех кандидатов ученые выбрали те LSR, которые, по-видимому, встраиваются в один сайт (всего 17 кандидатов). Они синтезировали гены этих LSR, а также их сайты attP и attB и опробовали их на человеческих клетках HEK293FT. Для этого авторы получили плазмиды, содержащие сайт attP и ген mCherry без промотора. Промотор ген приобретает после рекомбинации с плазмидой, содержащей сайт attB. В результате были идентифицированы 15 рабочих LSR, 13 из них работали лучше, чем PhiC31, а три — лучше, чем Bxb1.

После этого авторы проверили, насколько эффективно эти LSR встраивают фрагменты в человеческий геном. Для этого они сначала в случайном порядке внесли в геном клеток K562 «посадочные площадки» для LSR с помощью лентивирусов. Эти площадки содержали кандидатные LSR и GFP. Эксперимент был спланирован таким образом, что успешная рекомбинация плазмиды с сайтом attP приводит к активации гена mCherry и потере экспрессии LSR и GFP. Все пять протестированных LSR успешно работали с эффективностью 3–30% (у Bxb1 —1,5%). Дополнительные эксперименты показали, что эффективность интеграции LSR Pa01 может достигать 52% и даже 75% с помощью электропорации.

Для успешной рекомбинации Pa01 нужен сайт attB размером в 33 пары нуклеотидов, а другой LSR — Kp03 — всего 26 пар нуклеотидов. Дополнительный анализ выявил еще две многообещающие LSR — Si74 и No67. Kp03 в десять раз более эффективно, чем Bxb1, интегрировала линейные фрагменты-доноры, что намного упрощает создание библиотек.

Авторы выделили LSR, которые таргетируют человеческий геном, а также LSR, имеющие множество целей. Всего они синтезировали и функционально охарактеризовали 60 LSR. Так как для такой вставки фрагментов требуются только LSR и донорная ДНК, авторы ожидают, что их работа упростит методы генной терапии. Конечно, они упоминают еще и многие другие области применения найденных LSR для нужд генной инженерии.