Новый способ доставки компонентов системы CRISPR-Cas9 в печень поможет бороться с нарушением обмена липидов

Потеря функции ангиопоэтин-подобного белка 3 (Angptl3) связана со снижением уровня липидов в крови. Это делает Angptl3 привлекательной целью для генетической терапии у людей с нарушением обмена липопротеинов.

Ученые из США создали новые липидные наночастицы, которые доставляли компоненты системы CRISPR-Cas9 — мРНК Cas9 и гидРНК для нокаута Angptl3 в клетках печени у мышей.

Липидные наночастицы с разным составом были сформулированы из липиоидов, холестерина, фосфолипидов и метоксиполиэтиленгликоля. Чтобы проверить, наночастицы какого состава лучше таргетируют печень, в них загрузили мРНК люциферазы светлячка, после чего их вводили внутривенно мышам Balb/c дикого типа. Липидные наночастицы MC-3, одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, использовали в качестве контроля. Через шесть часов после доставки мРНК мышам вводили люциферин, после чего измеряли активность люциферазы.

Использование липидных наночастиц 306-O12B, 113-O12B, 306-O10B и MC-3 приводило к сравнимой биолюминесценции. Люцифераза экспрессировалась по большей части в печени. Для дальнейших опытов были выбраны липидные наночастицы 306-O12B. Их состав был оптимизирован.

Наночастицы с гидРНК LoxP вводили генетически модифицированным мышам, которые постоянно экспрессировали конструкцию Ai14 и Cas9. Репортерная конструкция Ai14 состоит из стоп-кассеты с LoxP по бокам, которая контролирует экспрессию репортерного гена tdTomato. Вырезание стоп-кодона ведет к появлению флюоресценции благодаря tdTomato. Ученые детектировали красную флюоресценцию в печени, особенно в гепатоцитах. Такие же результаты были получены при одновременной доставке мРНК Cas9 и гидРНК LoxP.

Следующим этапом в липидные наночастицы 306-O12B загрузили мРНК Cas9 и гидРНК Angptl3 и ввели C57BL/6 мышам. В качестве контроля использовали липидные наночастицы MC-3. Через семь дней после введения собрали плазму крови и образцы печени. T7E1 анализ, который обнаруживает неспаренные основания, и секвенирование нового поколения ДНК клеток печени показали редактирование генома в гене Angptl3. При использовании новых наночастиц степень редактирования была 38,5%, а при использовании MC-3 — 14,6%.

Анализ плазмы показал снижение уровня белка ANGPTL3 на 65,2%, липопротеинов низкой плотности-холестерина на 56,8% и триглицеридов на 29,4%. При использовании MC-3 эти показатели снизились на 25%, 15,7% и 16,3%.

Чаще всего редактирование генома заключалось в удалении или инсерции одного нуклеотида в месте разреза Cas9. Из девяти возможных сайтов, которые могла бы разрезать Cas9 вне цели, ни один не подвергся мутагенезу. При введении наночастиц не было отмечено токсичности для мышиного организма. Уровень цитокинов в плазме был повышен через шесть часов после введения наночастиц, но через 48 часов пришел в норму.

Терапевтический эффект сохранялся по крайней мере 100 дней после введения наночастиц. Ученые планируют продолжить эксперименты для определения максимальной длительности эффекта.