Новый способ получения флуоресцентных мРНК

При создании современных мРНК-вакцин в рибонуклеотиды вносят встречающиеся в природе модификации, заменяя урацил на псевдоуридин и цитидин на 5-метилцитидин. Это позволяет снизить иммунностимуляцию, повысить экспрессию белка и выживаемость клеток. Эффект связывают с изменениями во вторичной структуре РНК.

Чтобы изучить, как именно мРНК попадает в клетки, и визуализировать процессы, происходящие с ней, обычно используются флуоресцентные метки. Однако специфичная вставка флуоресцентных групп в такие длинные молекулы, как мРНК, остается сложной задачей. Пост-транскрипционная модификация при помощи катализируемых медью клик-реакций слишком токсична для клеток. Еще один подход позволяет вносить изменения либо в последний нуклеотид поли(А)-хвоста, либо в несколько случайных позиций этого участка. Таким образом, сайт-специфичное добавление модифицированных нуклеотидов в процессе транскрипции мРНК пока недоступно, но очень востребовано.

Ученые из Германии предложили использовать расширенный алфавит используемых рибонуклеотидов. При этом модификации вносятся в процессе транскрипции in vitro: неприродные нуклеотиды специфично встраиваются в 3'-нетранслируемый регион молекулы на выбранные исследователями позиции. В результате получали мРНК с одним или двумя неприродными рибонкулеотидами с циклопропеновыми группами.

Синтетические рибонуклеотиды, которые использовали авторы, легко вступают в обратную реакцию Дильса-Альдера. Чтобы воспользоваться этим свойством, необходимо добавить флуорофор. 1,2,4,5-тетразины поглощают волны длиной от 500 до 525 нанометров; соединения тетразина с флуорофором могут проникать в клетку. В результате клик-реакции с циклопропеном в модифицированной мРНК возникает флуоресценция. Это позволяет помечать молекулу мРНК и отслеживать ее судьбу в клетке.

На примере мРНК, кодирующей флуоресцентный белок mCherry, ученые проанализировали функциональность такой молекулы. Уровень трансфекции при помощи липосом у модифицированной мРНК оказался не менее высоким, чем у обычной. С модифицированной мРНК успешно проходила трансляция, и в клетках образовывалось значительное количество флуоресцентного белка mCherry. При помощи конфокальной микроскопии ученым удалось визуализировать мРНК в клетках. Наконец, клетки хорошо переносили трансфекцию модифицированной мРНК и добавление флуорофора и демонстрировали высокую выживаемость.

Таким образом, ученые представили новый инструмент, который позволяет следить за судьбой мРНК в клетках, не нарушая при этом жизнеспособность культуры. Кроме того, в ходе экспериментов авторы работы показали, что вместе с замещениями урацила на псевдоуридин и цитидина на 5-метилцитидин, добавление неприродных рибонуклеотидов улучшает трансляцию мРНК.