Описаны кольцевые РНК, уникальные для олигодендроцитов человека

Кольцевые РНК задействованы в регуляции экспрессии множества генов и особенно многочисленны в клетках головного мозга. Авторы нового исследования, опубликованного в Genome Biology, предложили новый метод для количественного и качественного анализа репертуара кольцевых РНК в клетках. Метод, получивший название CARP (от CircRNA identification using A-tailing RNase R approach and Pseudo-reference alignment), основан на опубликованном недавно протоколе получения обогащенного препарата кольцевых РНК.

В отличие от линейных РНК, кольцевые РНК устойчивы к действию РНКазы R. Получение препарата, обогащенного кольцевыми РНК, включает добавление поли(А)-хвостов к тотальной РНК и последующую обработку РНКазой R в присутствии буфера, содержащего ионы лития. В этих условиях разрушаются все линейные РНК, в том числе и те, которые содержат G-квадруплексы и устойчивы к РНКазе R в стандартных калиевых буферах. Кроме того, деградируют РНК с уникальными структурами на 3’-концах, например, мРНК, кодирующие гистоны.

Дальнейший анализ обогащенного кольцевыми РНК препарата включает секвенирование РНК. Существующие алгоритмы для выявления кольцевых РНК опираются на прочтениях, перекрывающих сайты бэксплайсинга (back-splicing) — особого этапа биогенеза кольцевых РНК. Только по этим прочтениям можно отличить кольцевые РНК от их транскриптов-предшественников. Однако методы, основанные на выявлении сайтов бэксплайсинга, не дают представления о полном разнообразии кольцевых РНК, так как различные молекулы могут иметь одинаковые участки бэксплайсинга. Авторы работы усовершенствовали технологию идентификации кольцевых РНК. Они объединили все последовательности кольцевых РНК, выявленные существующими алгоритмами, и сконструировали псевдореференсные последовательности для каждой кандидатной моелкулы. Такие последовательности содержат сайт бэксплайсинга и фланкирующие его 149 нуклеотидов. Объединение техники обогащения препарата с новым подходом к идентификации молекул и сформировало метод CASP.

Благодаря CASP можно получить существенно более развернутое представление о репертуаре кольцевых РНК, что ученые продемонcтрировали на клетках человеческой олигодендроглиомы (HOG).

С помощью CASP ученые выявили в клетках HOG около 39 000 кольцевых РНК и пронаблюдали динамику их количества в ходе дифференцировки олигодендроцитов. Более 2 000 кольцевых РНК были уникальными для олигодендроглии, при этом одна из них, circSLC45A4, подавляет дифференцировку клеток в нейроны.

Регуляция экспрессии некоторых уникальных для олигодендроглии кольцевых РНК происходит независимо от экспрессии их мРНК-предшественников. Более того, оказалось, что интроны, фланкирующие будущие кольцевые РНК в составе мРНК, часто содержат сайты редактирования и участки связывания факторов сплайсинга, экспрессия которых зависит от этапа дифференцировки клеток. Ряд кольцевых РНК, специфичных для олигодендроглии, выступает в роли «губок» для регуляторных микроРНК, таким образом влияя на дифференцировку клеток. Наконец, в некоторых случаях с одного гена может образовываться несколько альтернативных кольцевых РНК, причем то, какая кольцевая РНК получится, также зависит от программы дифференцировки клетки.