Отечественный «геном в бутылке» и эксперимент на студентах

Конференция «Геномное секвенирование и редактирование 2022», она же NGS-2022, состоялась 19 мая в РНИМУ им. Пирогова. Спикеры представили результаты работы Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины — одного из трех российских геномных центров мирового уровня, образованных в 2019 году. Отдельная секция была посвящена проекту неонатального экзомного скрининга, который работает на базе НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова.

Credit:
РНИМУ им. Пирогова

Конференцию открыл приветственным словом проректор РНИМУ им. Н.И.Пирогова Денис Ребриков. Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины функционирует на базе четырех организаций. Возглавляет консорциум ИМБ им. Энгельгардта РАН; в него также входят ИБГ РАН, РНИМУ им. Пирогова и ФНКЦ физико-химической медицины ФМБА. Ребриков — руководитель ветви геномного центра, базирующейся в НИИ трансляционной медицины РНИМУ.

На первой секции Дмитрий Коростин, зав. геномным центром НИИ трансляционной медицины, рассказал о первом отечественном «геноме в бутылке» (Genome in a Bottle, GIAB). Референсные сборки человеческого генома, хранящиеся в виртуальных базах, служат стандартами при выравнивании полученных в исследованиях геномных данных. GIAB — это физический стандарт, геномная ДНК в пробирке, которая служит эталоном при внедрении новых NGS-технологий. В список основных требований к GIAB входят его бесконечный источник в виде клеточной линии; полногеномная последовательность, полученная на разных платформах разными руками; биоинформатический анализ с помощью самых популярных инструментов; онлайн-ресурс, позволяющий купить пробирку и скачать все данные по этому геному. На сегодня самый популярный «геном в бутылке» —американский NA12878. Есть и другие, в том числе азиатский YH, с которым работает BGI. Отечественный стандартный геном сейчас находится на стадии разработки. Ему присвоено обозначение E701. Клеточной линии для поддержания генома пока нет, но существует пробирка с геномной ДНК, депонированная на -80°С. К настоящему времени выполнены полногеномное и полноэкзомное секвенирование и сформирован файл, объединяющий полученные данные. Спикер особо подчеркнул понимание и поддержку со стороны контролирующих органов. В планах — полногеномное секвенирование еще в трех–пяти российских лабораториях, создание клеточной линии, разработка интернет-ресурса и легализация стандарта.

Credit: РНИМУ им. Пирогова.

Вторая секция была посвящена исследованиям геномного центра. Первым выступил Денис Ребриков. Он осветил проблемы, возникающие на пути внедрения генной терапии в клинику. Ребриков начал с того, что на 2021 год в базе OMIM было зарегистрировано 7 000 наследственных заболеваний. При этом каждый человек несет не менее одной (по данным исследований, до 5–7) мутации. Однако зарегистрированных генотерапевтических препаратов единицы. Это связано с тем, что их нецелесообразно разрабатывать. Препараты выходят очень дорогостоящими, но сама по себе разработка недорогая — 97% цены приходится на лицензию. Компаниям это не выгодно. Есть и другой подход — вместо регистрации и серийного выпуска препарата «для всех» его можно изготавливать под конкретного ребенка. Это значительно снижает стоимость терапии. Срок изготовления персонализированного препарата составляет около месяца. В США есть регуляторный алгоритм, позволяющий разрабатывать и применять такую терапию. В России регуляторной рамки пока нет.

Спикер привел два случая разработки российскими учеными терапии под конкретного пациента. Создание препаратов заняло 2–3 месяца, однако пациенты их так и не получили из-за несовершенства законодательства. По мнению Ребрикова, необходимо внести изменения в федеральный закон «Об обращении лекарственных средств», которые позволят применять высокотехнологичную терапию по принципу hospital exemption — без регистрации, только в больнице при определенных обстоятельствах. Другой путь — внесение соответствующих изменений в законодательство ЕАЭС. Одна из слушательниц уточнила, что такие изменения были приняты 17 марта 2022 года. Следующий шаг — разработка внутреннего регламента Минздравом РФ.

Еще один подход к борьбе с моногенными заболеваниями — доступ каждого человека к собственным генетическим данным. Вероятность рождения больного ребенка от двух родителей с одинаковой мутацией в гетерозиготе составляет 25%. Если люди будут образовывать пары с учетом собственных мутаций и мутаций партнера, дети с моногенными заболеваниями перестанут рождаться. Денис Ребриков рассказал об эксперименте на студентах РНИМУ. В нем приняли участие 1 000 человек. Участников проверили на четыре самых распространенных генетических заболевания, присвоили каждому QR-код и сформировали базу данных. QR-код можно было повесить, например, на рюкзак, чтобы каждый заинтересованный человек противоположного пола мог его считать и решить, стоит ли приглашать его обладателя на свидание. По словам Ребрикова, в результате эксперимента теоретически было предотвращено рождение нескольких больных детей.

Следующим выступил Артем Давлетшин, сотрудник ИМБ им. Энгельгардта, с докладом о получении более специфичных и активных вариантов нуклеазы SpyCas9 (белок Streptococcus pyogenes) путем белковой эволюции. Лаборатория, в которой работает спикер, разработала тест-систему на основе дрожжей для оценки работы SpyCas9. Нуклеазу направили на ген ADE2, повреждение которого приводит к накоплению в клетках дрожжей красного пигмента. Активность нуклеаз оценивали на чашках Петри по соотношению красных и белых колоний. Новые варианты SpyCas9 получали также в дрожжах. Ученые проверили около 40 вариантов нуклеаз относительно Cas9 дикого типа. Кроме активности они анализировали также специфичность (чувствительность к гидовой РНК) и PAM-специфичность. Некоторые варианты обладали высокой специфичностью, но низкой активностью. В ходе исследования была выявлена мутация в домене распознавания PAM, которая восстанавливает активность этих вариантов, не влияя на специфичность.

Следующий спикер Эрдем Дашинимаев, с. н. с. Центра компетенции по анализу единичных клеток — одного из подразделений геномного центра в РНИМУ, рассказал о системах трансактивации генов на основе CRISPR/dCas9. Одно из применений трансактиваторных CRISPR-систем — прямое репрограммирование фибробластов, например, в бета-клетки поджелудочной железы или в ГСК. Лаборатория Дашинимаева сравнила эффективность систем первого (CRISPR/dCas9-VP160) и второго (CRISPR/dCas9-SunTag и CRISPR/dCas9-VPR) поколений. Ученые показали, что VP160 уступает системам второго поколения, а система VPR способна достоверно активировать экспрессию генов бета-клеток и ГСК в культуре фибробластов кожи человека. При этом чем дольше клетки культивируются, тем сильнее выражена активация.

Доклад Олега Подгорного (РНИМУ им. Пирогова) был посвящен термогенетике — методу управления активностью возбудимых клеток. Он рассказал о термогенетической системе на основе канала TRPA1 курицы и о ее проверке на клетках и мышах. Канал термочувствительный и проводит ионы кальция. Он активируется при температуре около 40°C. Нагрев до этой температуры безопасен для клеток. В клетки вводился ген TRPA1 вместе с кальциевым биосенсором. Эксперимент на клетках проводился по следующей схеме: нагрев, затем кальциевый имиджинг. Ученые отметили, что канал не десенситизируется после первого нагревания. После успешных опытов на клетках HEK, HeLa и нейронах метод применили к мышам. Конструкт вводили с помощью смеси векторов AAV2/9, мышь нагревали ИК-лазером. Ответы на термостимуляцию регистрировались и на первый, и на второй день эксперимента. Спикер отметил, что термогенетический подход имеет ряд преимуществ перед опто- и хемогенетикой и в перспективе может применяться в медицинских целях.

Завершил секцию доклад Алексея Дмитриева, сотрудника ИМБ им. Энгельгардта. Он рассказал о de novo сборке геномов мужского и женского растений тополя Populus × sibirica, произрастающего на территории Москвы. Для сборки использовались платформы Oxford Nanopore и Illumina. Важным этапом была очистка ДНК для нанопорового секвенирования. Для растений не существует универсальных протоколов, поэтому около года ушло на оптимизацию пробоподготовки и очистки ДНК от коротких фрагментов. Длина сборки превышала ожидаемую, что говорило о присутствии в ней гаплотипов. Ученые разделили гаплотипы с помощью биоинформатических инструментов и определили предковые виды. Кроме того, они нашли локус, связанный с полом тополя, а в нем специфичные для тополя повторы (populus-specific repeat, PSR). Возможно, именно PSR отвечает за разделение полов у тополей. Это открытие важно для принятия решений при озеленении городов.

Credit: РНИМУ им. Пирогова.

Следующая секция была целиком посвящена проекту неонатального скрининга новорожденных «ЭКЗАМЕН». Название проекта — аббревиатура, которая расшифровывается как экзомный клинически значимый анализ мутаций единичных нуклеотидов. «ЭКЗАМЕН» стартовал в мае 2021 года на базе НМИЦ АГП им. Кулакова и должен быть завершен в декабре 2022-го. Проект работает по следующей схеме. Участие предлагают всем будущим родителям, ребенок которых должен появиться на свет в стенах медицинского центра. Если родители подписывают информированное согласие, после родов для анализа отбирается пуповинная кровь со стороны ребенка и со стороны плаценты, проводится секвенирование и биоинформатический анализ полученных данных. Если у новорожденного нет особенностей фенотипа, он проходит неонатальный скрининг и расширенный скрининг (полноэкзомное секвенирование). Если особенности фенотипа есть, в дополнение к расширенному скринингу назначаются исследования, учитывающие их. По каждой находке проводится мультидисциплинарный консилиум, по результатам которого формируется заключение. Для детей с фенотипом через 1–2 года проводится повторный анализ данных.

Промежуточные результаты «ЭКЗАМЕНа» представил Дмитрий Трофимов, директор Института репродуктивной генетики НМИЦ АГП им. Кулакова. С 1 мая 2021 г. на момент доклада было собрано 9 063 образца пуповинной крови, 6 875 образцов секвенировано и 3 176 образцов проанализировано. У «здоровых» детей (ок. 3 000) нашли 12 мутаций в экзонах и 3 вариации числа копий — всего 15 находок. Для детей с фенотипом (207 человек) эти показатели составили 29 и 15, всего 44 находки. Частота находок для здоровых детей была равна 0,5%, для детей с фенотипом — 22%. У 29 пациентов с фенотипом выявлены патогенные и вероятно патогенные варианты, у 57 — варианты неясной значимости, у 15 — хромосомная патология. У 15 из «здоровых» детей обнаружены патогенные и вероятно патогенные варианты.

Разрыв между количеством собранных и проанализированных образцов Трофимов объяснил тем, что в начале проекта для секвенирования использовался прибор MGI. Он не справлялся с потоком, и в итоге его заменили на более производительный Illumina NOVASEQ 6000, но за время работы MGI успели скопиться необработанные образцы. Кровь детей с фенотипами отправляется на анализ без очереди, «зависли» только образцы от детей без патологических проявлений. Еще одно изменение, внесенное в проект в этом году, касается манипуляций с полученными данными. Команда внедрила дополнительное согласие, которое может быть подписано до или после родов. Оно влияет на то, о каких генетических вариантах врачи сообщат семье. Кроме того, в нем предоставлена возможность распоряжения данными генетического анализа. К узким моментам проекта относится, в частности, биоинформатический анализ: важно автоматизировать его и при этом ничего не упустить. В настоящее время используются готовые программы, но ученые также разрабатывает собственный софт NGS-App.

Трофимов отметил, что неонатальный скрининг имеет прямую связь с преконцепционным скринингом. Во-первых, рождение ребенка с наследственным заболеванием побуждает пару внимательно отнестись к планированию следующих беременностей. Во-вторых, если выявлено гетерозиготное носительство, эту информацию могут использовать другие члены семьи при планировании собственных детей. В-третьих, результаты неонатального скрининга могут стать поводом для преконцепционного скрининга следующего поколения. Однако есть тонкости, связанные с законодательством. Геном — это персональная информация, он охраняется соответствующими законами. Однако неонатальный скрининг дает информацию не только о младенце, но и о его родителях (например, о семейных онкологических рисках). По мнению Трофимова, геномные данные следует сделать не персональной, а семейной информацией. При этом нужно повышать информированность населения, так как знания, например, о гетерозиготном носительстве могут стать токсичными, если человек недостаточно разобрался в вопросе.

Анна Большакова, врач-генетик НМИЦ АГП им. Кулакова, рассказала о клинической значимости «ЭКЗАМЕНа». Она отметила, что в конкретном медицинском центре концентрируются дети с аномалиями, и с помощью NGS можно установить этиологию в более чем 50% случаев. Значимость полноэкзомного секвенирования Большакова проиллюстрировала несколькими кейсами.

Так, у одного из «здоровых» детей обнаружили патогенный вариант в гене MEFV в гомозиготном состоянии, связанный с семейной средиземноморской лихорадкой. Эта находка предотвратит необоснованное хирургическое вмешательство в будущем и поможет предупредить амилоидоз почек. Второй «здоровый» ребенок оказался носителем гетерозиготного варианта, описанного для пациентов с синдромом Марфана и семейной аневризмой аорты. В этом случае знание о мутации поможет избежать серьезных сердечно-сосудистых осложнений.

Анна Большакова рассказала и о четырех младенцах с фенотипами. В двух случаях были обнаружены описанные ранее патогенные варианты с аутосомно-рецессивным типом наследования. У одного ребенка не было обнаружено патогенных или вероятно патогенных вариантов в экзоме, кариотип был нормальным. Через полтора месяца после рождения ребенок погиб. Полноэкзомное секвенирование трио родитель-ребенок выявило de novo гетерозиготный вариант в гене MED13, связанный с нарушением интеллектуального развития в базе OMIM. У четвертого ребенка патогенные варианты не были обнаружены ни при первом полноэкзомном секвенировании, ни при полноэкзомном секвенировании трио. В возрасте 1 мес. его выписали домой, в 9 мес. врачи центра констатировали нарушения развития нервной системы. Планируется полногеномное секвенирование трио.

Подытоживая все сказанное, Большакова отметила, что своевременная постановка молекулярно-генетического диагноза позволяет в ряде случаев назначить специфическое лечение, уточнить прогноз и оценить риски для потомства, то есть дать родителям репродуктивный выбор.

Команда проекта «ЭКЗАМЕН» собрана из специалистов разных профилей. За социогуманитарное направление отвечает Елена Гребенщикова, зав. кафедрой биоэтики лечебного факультета РНИМУ им. Пирогова. По ее словам, общество приветствует все новое, особенно в медицинской сфере. Однако медицинская генетика — это особая область, в которой недостаточно гиппократовской этики. Неясно, как пациенты относятся к пенетрантности и оценке генетического риска. Появляется новый тип пациента — пациент в ожидании.

Гребенщикова представила результаты опроса, проведенного среди 318 матерей, которые согласились на участие в проекте. Большинство из них подписали согласие, так как видели в этом необходимость и хотели знать всю возможную информацию. Более половины матерей не советовались с другими членами семьи при принятии решения. Около 95% респондентов доверяют медицинской генетике.

Один из важнейших вопросов, который встает перед командой проекта, — что сообщать родителям. Из всех опрошенных матерей 82,4% хотели бы получить информацию о генетических заболеваниях, связанных с высоким риском для ребенка, для которых существует лечение. Более 60% респондентов также хотели бы знать о вариантах среднего и высокого риска для ребенка независимо от того, есть ли лечение для соответствующих заболеваний, а также о высоком или среднем риске для других членов семьи.

О возможном заболевании ребенка, вероятность которого составляет 50%, хотели бы знать 75,8% матерей. При проработке этого вопроса выяснилось, что матери по-разному оценивают риск для себя и для ребенка. Одна из участниц в развернутом ответе призналась, что не хотела бы ничего знать про себя из-за сильной мнительности, однако про ребенка она должна знать все, чтобы быть готовой к любому повороту событий. Некоторые матери посчитали вероятность 50% слишком низкой, другим же и 30-процентная вероятность казалась большой.

В финале доклада Елена Гребенщикова, как и Дмитрий Трофимов, подчеркнула важность информирования населения о генетическом тестировании.

Помимо научных докладов в программу NGS-2022 вошла экскурсия в сиквенс-центр РНИМУ. Ее провел Денис Ребриков. Сиквенс-центр располагается в новом корпусе университета и занимает две лаборатории: одна для пробоподготовки, во второй установлены два прибора DNBSEQ-G400 (MGI) и сервер для обработки данных.

Денис Ребриков проводит экскурсию в сиквенс-центре РНИМУ. Credit: Ирина Конова.

В рамках конференции также прошли секции, посвященные применению NGS в клинической диагностике и микробиологии.

Добавить в избранное

Вам будет интересно