PAC-MANN обнаруживает рак поджелудочной железы на ранних стадиях

Исследователи из Орегонского университета науки и здравоохранения (OHSU) нашли биомаркер аденокарциномы протоков поджелудочной железы и разработали тест для раннего выявления этого заболевания.

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) — третья по распространенности причина смерти от онкозаболеваний. Симптомы рака поджелудочной железы неспецифичны, и это затрудняет раннюю диагностику. Пятилетняя выживаемость пациентов на поздних стадиях составляет всего лишь 3%, но на ранних стадиях она намного выше — 44 %. Ранняя постановка диагноза может значительно улучшить прогноз. Однако единственный одобренный FDA клинический биомаркер PDAC — углеводный антиген 19-9 (CA 19-9) — используется для контроля тяжести заболевания во время лечения, но не для его раннего выявления из-за низкой прогностической ценности.

Идеальные маркеры для ранней диагностики протоковой аденокарциномы поджелудочной железы — протеазы. Опухолевые и стромальные клетки поджелудочной железы активно выделяют матриксные металлопротеиназы (ММП), которые разрушают внеклеточный матрикс и играют важную роль в возникновении и прогрессировании рака. Хронический панкреатит — воспалительное заболевание, при котором повышен риск развития рака, — связан с повышением уровня трипсин- и химотрипсинподобных протеаз. Таким образом, профиль протеаз может помочь отличить состояния здоровья, воспаления и рака.

Авторы исследования взяли за основу ранее разработанный метод оценки активности протеаз в образцах цельной крови и создали новый неинвазивный тест PAC-MANN, с помощью которого можно отличить образцы больных раком и здоровых людей.

Метод изменения заряда протеазой (charge-changing protease assay, CCP) основан на детекции активности фермента. На присутствие протеазы в образце указывает появление продукта расщепления пептидного зонда; в то время как нерасщепленный зонд имеет отрицательный заряд, один из фрагментов расщепления заряжен положительно и несет флуоресцентную метку, так что его можно детектировать с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. (С принципом метода можно ознакомиться в препринте тех же авторов на рис.1).

Исследователи создали панель из шести пептидных зондов, которые в общей сложности содержали 26 уникальных и 11 общих сайтов расщепления протеазами. Такой набор сайтов дает возможность идентифицировать более сотни протеаз.

Панель протестировали на пациентах с PDAC (67 человек), панкреатитом (11 человек), новообразованиями поджелудочной железы, как доброкачественными, так и ассоциированными с высоким риском PDAC (21 человек) и здоровых контролях (67 человек). Картина протеазной активности в сыворотке крови существенно отличалась не только у больных PDAC и здоровых людей, но и давала возможность дифференцировать от PDAC панкареатит и неоплазию. Разные стадии PDAC эта панель не позволяла достоверно различать, но изменения появлялись уже на первой стадии.

Созданная панель содержала сайты для широкого спектра протеаз. Ученые решили найти в исследуемых образцах конкретную протеазу или протеазы, которые расщепляли зонды. С помощью жидкостной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS) они изучили пул пептидных фрагментов, образующихся после анализа сыворотки пациентов с PDAC и здоровых контролей, и определили преобладающие сайты расщепления. Затем они провели поиск в базе данных ProCleave, где указаны вероятности расщепления пептидных сайтов различными протеазами. В базе были хорошо представлены три семейства протеаз, активирующихся при раке, — катепсины, каспазы и матриксные металлопротеиназы (ММП); последние могли расщеплять наибольшее количество зондов. С помощью ингибиторов и анализа активности разных протеаз семейства ученые выяснили, что ключевую роль в изменении картины расщепления при PDAC играет протеаза MMP2.

В дальнейших экспериментах авторы использовали только один зонд, результаты расщепления которого значительно различались у больных и здоровых. По активности циркулирующей в крови MMP2 они смогли отличить PDAC от контроля с точностью 79± 6 %.

Чтобы облегчить клиническое применение метода, авторы разработали технологию, которую назвали PAC-MANN (protease activity-based assay using a magnetic nanosensor). В этом варианте не требуется гель-электрофорез. Флуоресцентно меченный зонд ковалентно связан с наночастицей оксида железа диаметром 50 нм, что позволяет удалять из раствора нерасщепленные пептиды с помощью магнита и считывать флуоресценцию только продуктов расщепления  (препринт, рис.4).

В слепом ретроспективном исследовании новый метод выявил образцы PDAC со специфичностью 98 % и чувствительностью 73 % на всех стадиях и со 100 %-ной точностью различил пациентов с раком и нераковыми заболеваниями поджелудочной железы. В сочетании с клиническим биомаркером CA 19-9 он обнаружил PDAC первой стадии со специфичностью 96 % и чувствительностью 85 %. Авторы также показали, что неоадъювантная терапия или хирургическое удаление первичной опухоли уменьшает сигнал PAC-MANN.

Таким образом, предложенный авторами метод может повысить точность анализа на CA 19-9 и легко может быть оптимизирован для выявления других протеаз. Он проводится быстро и требует небольших объемов крови (достаточно 8 мкл, тогда как, например, для анализа метилирования циркулирующей ДНК требуется 10 мл). По мнению авторов, он имеет потенциал для тестирования групп риска или населения регионов, где доступ к лабораторной диагностике затруднен.

Раскрыт механизм развития кахексии у больных раком поджелудочной железы