Патогенную микробиоту рта можно исследовать с помощью CRISPR

Заболевания ротовой полости, такие как периодонтит и кариес, имеют инфекционную природу. Однако детектирование оральных микроорганизмов и профилирование микробиоты остается дорогим, медленным и технически сложным. Изменить эту ситуацию может CRISPR-Dx — молекулярная диагностика, основанная на системе CRISPR-Cas. Авторы новой статьи использовали метод SHERLOCK, о котором мы не раз писали, для быстрого и дешевого изучения микробных сообществ в ротовой полости.

В настоящее время для изучения микробиоты рта чаще всего используются методы, основанные на количественной ПЦР (qPCR) и секвенировании следующего поколения (NGS). Но эти методы сложно масштабировать для массового профилирования микробных сообществ ротовой полости. В качестве альтернативы авторы предлагают метод SHERLOCK, который использует систему на основе CRISPR-Cas13a. Когда эта система узнаёт участок-мишень, нуклеаза Cas13a проявляет нецелевую активность — разрезает репортерную РНК, которую специально для этого добавляют в образец вместе с CRISPR-системой. Репортерная РНК несет на одном конце флуоресцирующую группу, на другом — группу-гаситель; когда молекула разрезана, эти группы удаляются друг от друга, и возникает флуоресцентный сигнал, который может быть измерен. Для повышения чувствительности таргетные участки бактериальных геномов в образце предварительно амплифицируют. В данном случае использовали изотермическую амплификацию RPA — при этом температура реакции позволяет проводить амплификацию и детекцию в одном реакционном объеме, в формате one pot.

Первым шагом авторы разработали алгоритм для дизайна видоспецифичных прямых и обратных праймеров для амплификации, а также направляющих РНК. Они выбрали маркерные гены интересующих видов бактерий с помощью MetaPhlAn 4.0. и чтобы валидировать разработанный алгоритм, синтезировали семь сетов праймеров и направляющих РНК, каждый из которых был нацелен на определенный ген-маркер одного из семи видов бактерий ротовой полости. Среди них были Streptococcus mutans (Sm), который вносит основной вклад в развитие кариеса, а также Porphyromonas gingivalis (Pg), Scardovia wiggsiae (Sw), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Klebsiella pneumoniae (Kp), Acinetobacter baumannii (Ab) и Staphylococcus aureus (Sa). Все семь сетов продемонстрировали эффективность в экспериментах с геномами целевых бактерий; негативный контроль, не содержащий бактериальной ДНК, флуоресценции не давал.

Далее авторы проверили чувствительность и специфичность своей тест-системы. Сравнение флуоресцентного сигнала каждого из сетов в ответ на целевые и нецелевые геномные ДНК бактерий, показало десятикратную разницу в интенсивности. Аналогичный результат был получен с образцами слюны, не содержащими целевых бактерий.

Затем исследователи перешли к анализу необработанных образцов слюны (без очистки и центрифугирования). В этом варианте метод модифицировали: добавили в реакционную смесь EGTA и DTT, чтобы ингибировать РНКазы слюны, и увеличили температуру до 95 °С для лизирования клеток бактерий. На эффективность анализа модификации не повлияли. Образцы получили от 30 человек, не лечившихся ни от каких болезней ротовой полости в течение трех предшествующих месяцев, не принимавших антибиотики и не делавших антибактериальных полосканий. Состав микробиома оценивали как с помощью нового метода, так и с помощью золотого стандарта — секвенирования генов бактериальных 16S РНК.

Секвенирование 30 образцов слюны обнаружило в общей сложности 202 бактериальных видов (в одном образце от 33 до 102). В некоторых образцах было выявлено присутствие бактерий Sm, Pg и Sw. Еще четыре вида (Aa, Kp, Sa, Ab) обнаружены не были. Далее авторы применили метод SHERLOCK-EGTA+DTT на этих же 30 образцах, используя сеты для Sm, Pg и Sw бактерий. Совпадение между методами было стопроцентным: одинаковые виды бактерий были обнаружены в одних и тех же образцах как 16S-секвенированием , так и методом SHERLOCK-EGTA+DTT. Информация о видовом составе микробиома, полученная с помощью секвенирования, подтвердила высокую специфичность CRISPR-диагностики: например, направляющая РНК против Sm не взаимодействовала с геномами других видов стрептококка.

Таким образом, для анализа патогенной оральной микробиоты можно использовать метод SHERLOCK, который позволяет получать результат быстрее и дешевле альтернативных методов.

Новое портативное устройство одновременно определяет РНК SARS-CoV-2 и антитела к нему в слюне