Пептид двойного действия предотвращает развитие таупатии у дрозофилы

Болезнь Альцгеймера — тяжелое нейродегенеративное заболевание, обусловленное накоплением токсичных белковых агрегатов в головном мозге. Так, тау-белок в норме растворен в цитоплазме, но при определенных условиях он изменяет свою вторичную структуру и формирует нерастворимые включения внутри клеток. При этом за мисфолдинг (неправильную укладку) тау-белка отвечают как определенные мотивы в его первичной структуре, так и посттрансляционные модификации, в частности, гиперфосфорилирование. В новой работе исследователи из Великобритании, США и Японии разработали пептиды, которые избирательно влияют на мотивы внутри тау-белка, препятствуя его агрегации.

Авторы показали, что в структуре тау-белка содержатся два участка, отвечающие за олигомеризацию и формирование нерастворимых включений. Первый фрагмент — ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ — состоит из шести аминокислот и встречается во всех шести изоформах тау-белка. Другой гексапептид — ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ — имеется только в трех из шести изоформ этого белка. Часть молекул, рассматриваемых как потенциальные лекарства от болезни Альцгеймера, могут связываться с тем или иным мотивом в тау-белках, однако ни одна из молекул не способна взаимодействовать с обоими фрагментами сразу. Для разработки подобной молекулы ученые взяли за основу фрагмент ³⁰⁶VQIVYK³¹¹ и последовательно заменяли аминокислоты. После этого они тестировали полученные гексапептиды при помощи молекулярного докинга и смотрели, какие из них могут взаимодействовать с исходным мотивом ³⁰⁶VQIVYK³¹¹.

После отбора наиболее перспективных кандидатов in silico исследователи синтезировали 19 различных пептидных молекул с определенными модификациями, улучшающими растворимость пептидов. Далее они протестировали in vitro способность каждого пептида влиять на агрегацию тау-белка, а также агрегировать самостоятельно. Последний момент очень важен, так как именно мотив ³⁰⁶VQIVYK³¹¹, взятый за основу при разработке новых пептидов, отвечает за патологические свойства тау-белка. Выбрав из 19 молекул ту, которая обладала способностью ингибировать агрегацию тау-белка и при этом не имела склонности к агрегации, исследователи подвергли ее дальнейшей модификации. Например, они использовали D-изомеры аминокислот и перевернули последовательность пептида, чтобы последняя аминокислота стала первой, а первая — последней. Такая мера снизила вероятность протеолитического расщепления пептида в клетке и увеличила способность пептида проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Полученную в итоге молекулу назвали RI-AG03 и протестировали in vitro и in vivo.

При взаимодействии как с целым тау-белком (Tau^2N4R), так и с его версией, укороченной с N-конца (Tau^Δ1-250), которую используют в исследованиях из-за ускоренной кинетики агрегации, RI-AG03 препятствовал формированию агрегатов. Более того, RI-AG03 подавлял агрегацию пептидов ²⁷⁵VQIINK²⁸⁰ и ³⁰⁶VQIVYK³¹¹, отвечающих за мисфолдинг тау-белка. Используя методы циркулярного дихроизма и спектрофотомерии в присутствии тиофлавина Т — маркера β-листов в белках — ученые выяснили, что тау-белок формирует растворимые аморфные глобулы в присутствии RI-AG03.

При этом RI-AG03 предотвращала агрегацию тау-белка при переходе из растворимой в нерастворимую форму. Добавление RI-AG03 к уже сформированным агрегатам Tau^2N4R и Tau^Δ1-250 не оказывало никакого эффекта и не способствовало растворению агрегатов.

Далее ученые оценили влияние RI-AG03 на клетки млекопитающих. Без ингибитора тау-белок накапливался внутри клеток, но в присутствии RI-AG03 белок не формировал агрегаты. Эффективность данного пептида в подавлении агрегации зависела от дозы, при этом сам пептид не показал токсичности по отношению к клеткам в исследуемом диапазоне доз.

Наконец, авторы оценили способность пептида подавлять прогрессирование таупатии у плодовых мушек. Известно, что трансгенные мушки, экспрессирующие человеческий тау-белок (hTau^2N4R), имеют многочисленные нарушения развития, в том числе когнитивный дефицит, сниженную продолжительность жизни и определенную аномалию в форме глаз, вызванную дегенерацией фоторецепторов, так называемый «шершавый глаз» (rough eye). При помощи сканирующей электронной микроскопии исследователи выяснили, что наличие RI-AG03 в диете может частично препятствовать изменению формы глаза.

Кроме того, мушки, которые получали RI-AG03 с пищей, не демонстрировали явных признаков токсичности этого пептида. Так, медианная продолжительность жизни дрозофил, принимавших как низкие (0,08 мМ), так и высокие дозы (0,8 мМ) пептида, составляла 67–70 дней. При этом медианная продолжительность жизни контрольных мушек, экспрессировавших тау-белок человека, составляла 26 дней без лечения, а добавление как низких, так и высоких доз ингибитора агрегации в диету увеличивало продолжительность жизни на 27% и 35%, до 33 и 35 дней соответственно.

Для оценки накопления нерастворимых агрегатов тау-белка ученые проанализировали фракции этого белка в нервной системе дрозофил. В отсутствие лечения тау-белок накапливался как в форме олигомеров, так и в форме нерастворимых фибрилл. Однако наличие RI-AG03 в диете уменьшало присутствие агрегатов тау-белка в тканях дрозофил на 73%.

Способность RI-AG03 избирательно связываться с двумя мотивами, ответственными за агрегацию, отличает его от существующих молекул, а способность проникать через ГЭБ и отсутствие токсичности делают его потенциальным кандидатом для тестирования на млекопитающих моделях болезни Альцгеймера.

RING-Bait разбирает агрегаты тау-белка и улучшает двигательную функцию у мышей с таупатией