Петр Шаталов: как построить внутри организма завод по производству неоантигенов

Кандидат биологических наук, руководитель молекулярно-генетической службы НМИЦ радиологии Минздрава Петр Шаталов выступил на «Метафазе» с лекцией «Анализ ДНК опухоли: точная диагностика и создание неоантиген-направленной терапии».

Диагностика как основа современной онкологии

Современная онкология — это прежде всего диагностика, и основные прорывы последних лет так или иначе связаны с биомаркерной диагностикой, выполняемой морфологическими либо молекулярно-генетическими методами.

Рак — это не одно заболевание, а группа состояний, при которых клетки приобретают способность к неконтролируемому росту, инвазии в окружающие ткани и распространению по организму, напомнил лектор. Двух одинаковых опухолей не существует.

Опухолевая ткань может сильно отличаться от здоровой: сосуды в ней работают неправильно, нарушается кровоток, повышается давление, а вокруг клеток накапливается плотный внеклеточный матрикс — своего рода барьер из коллагена и других компонентов. В результате Т-лимфоцитам становится сложнее добраться до опухолевых клеток и атаковать их. Так опухоль может частично укрываться от иммунной системы.

 Морфология здоровой ткани и ткани, пораженной опухолью

Герминальные и соматические мутации

Мутации возникают во всех клетках организма — именно поэтому каждый человек уникален. В онкологии принципиально важно различать два их типа. Герминальные (наследственные) мутации присутствуют во всех клетках организма с рождения и могут передаваться потомству. С ними связано примерно 5–10% всех случаев онкологических заболеваний, в том числе наследственные формы рака молочной железы и яичников. Однако около 90% диагностированных случаев вызваны соматическими мутациями (например, в генах BRAF, EGFR, KRAS, NRAS), которые накапливаются в клетках в течение жизни и присутствуют только в опухоли.

Наследственные формы онкозаболеваний могут вызывать мутации в генах BRCA1/2, PALB2, CHEK2, MLH1 (последний связан с синдромом Линча — колоректальным раком, раком эндометрия, желудка и яичников). Выявление патогенной мутации в определенных генах существенно повышает риск развития ассоциированной опухоли, подчеркнул Петр Шаталов. Поэтому носительницам мутаций в BRCA предлагают профилактическую мастэктомию.

От типа опухоли и клинической задачи зависит выбор биоматериала для молекулярно-генетической диагностики. Герминальные мутации присутствуют во всех клетках, включая клетки крови, а для детекции соматических мутаций берут биопсийные образцы опухоли.

  Сравнение методов диагностики при наследуемых и спорадических формах рака   

От «одного лекарства для всех» к персонализированной терапии

Эволюцию противоопухолевой терапии докладчик описал как движение от неспецифического препарата-«блокбастера» к таргетной терапии, направленной на определенный маркер, и затем к персонализированному подходу. Этот путь занял больше века.

Классическая химиотерапия убивает раковые клетки, но, по сути, она убивает все быстро делящиеся клетки в организме, то есть ее токсичность высока. Именно поэтому у пациентов выпадают волосы — волосяные фолликулы относятся к тканям с наиболее активным клеточным делением.

Таргетная терапия и иммунотерапия значительно менее токсичны и более эффективны, но назначать их можно только тем пациентам, у кого в опухоли идентифицирован соответствующий биомаркер — мишень, с которой будет взаимодействовать лекарство. К настоящему моменту известно более 200 генов, при выявлении определенных вариантов которых можно назначить конкретное лечение.

Биомаркеры, подчеркнул докладчик, могут быть терапевтическими, прогностическими или диагностическими, то есть определять не только выбор препарата, но и прогноз течения заболевания или объем хирургического вмешательства.

Онкологическая помощь в России

В 2024 году в Российской Федерации было диагностировано 698 693 новых случая злокачественных новообразований при численности населения 146,1 млн человек; общий показатель заболеваемости — 477,6 на 100 тысяч населения. Наиболее распространенные локализации — немеланомный рак кожи (13,5%), рак молочной железы (12,2%), рак предстательной железы (9,5%), рак легких, бронхов и трахеи (8,6%), рак толстой кишки (7,1%) и рак желудка (4,8%).

Лектор специально остановился на доступности онкодиагностики в России. За последние десять лет ситуация значительно улучшилась, отметил он: если раньше молекулярно-генетические исследования были фактически недоступны для пациентов и нередко оплачивались через благотворительные фонды, то сейчас исследование на ключевые биомаркеры при основных типах злокачественных новообразований выполняются бесплатно за счет средств ОМС при наличии направления и показаний. Молекулярно-генетическая служба НМИЦ радиологии объединяет лаборатории трех институтов — МНИОИ им. П.А. Герцена, МРНЦ им. А.Ф. Цыба и НИИ урологии им. Н.А. Лопаткина — и ежемесячно проводит более 1000 целевых тестов и более 800 NGS-исследований. Центр работает и как справочная площадка для регионов: биоматериал забирают из субъектов, где собственная молекулярно-генетическая служба не развернута, и пациент получает результат за три-четыре недели.

Методы: ПЦР, Сэнгер, NGS

Подходы к анализу нуклеиновых кислот Петр Шаталов разделил на две группы. Генотипирование (методом ПЦР или на микрочипах) прицельно считывает конкретные нуклеотиды с известными геномными координатами. ПЦР в онкологии широко используется для поиска известных мутаций, она выявляет клинически значимые варианты в генах, чтобы затем можно было выбрать тактику диагностики и терапии.

Секвенирование позволяет прочитать нуклеотидную последовательность целиком вместо того, чтобы определять одну «букву»: методом Сэнгера — небольшой участок, методом NGS (секвенирование следующего поколения, оно же высокопроизводительное или массивное параллельное секвенирование) — обширные области генома. Секвенирование методом Сэнгера применяется для поиска мутаций в отдельных генах, оно подтверждает клинически значимые варианты, используется при анализе известных мутаций. NGS применяется для поиска клинически значимых мутаций и позволяет исследовать много генов одновременно.

Лектор объяснил, почему в онкологии почти всегда используют таргетные панели, а весь геном или экзом (совокупность кодирующих последовательностей) исследуют не так часто. Полный геном — это около 90 ГБ данных на образец с покрытием 30×. В то же время опухоль гетерогенна (не все ее клетки имеют одинаковые мутации), и ее доля в образце может составлять 20–30%. При недостаточно высоком покрытии биоинформатический алгоритм рискует отфильтровать реальную мутацию как ошибку секвенирования. Таргетная же панель при том же объеме данных обеспечивает покрытие около 1500 прочтений на нуклеотид, что и дает необходимую точность. Кроме того, практическую значимость для подбора терапии сегодня имеют лишь 300–400 генов — секвенировать весь экзом (22 000 генов) нет смысла.

Отдельная разновидность таргетной панели используется для типирования HLA (Human Leukocyte Antigens) — набора генов, определяющих совместимость тканей. Определение HLA позволяет оценить иммунологическую совместимость донора и реципиента. Чем выше HLA-совместимость донора и реципиента, тем ниже риск отторжения трансплантата.

Особое место в диагностике занимает жидкостная биопсия — определение свободно циркулирующей опухолевой ДНК в крови. Метод применяется для мониторинга эффективности терапии, скрининга рецидивов и ранней диагностики. Опухолевая ДНК появляется в кровотоке заметно раньше, чем изменения становятся видны на КТ.

Неоантигены и персонализированные вакцины

Центральной темой второй части лекции стали неоантигены — новые опухоль-специфические антигенные пептиды, возникающие из-за мутаций в опухолевой клетке и отсутствующие в нормальной ткани. Изменение в ДНК приводит к синтезу измененного белка, который расщепляется клеткой на короткие пептиды, представляемые на ее поверхности молекулами главного комплекса гистосовместимости <(МНС) У человека они называются HLA: это те самые поверхностные молекулы, которые определяют тканевую совместимость, но их функция, важная с точки зрения терапии рака, — представление (презентация) фрагментов различных белков клетки, чтобы их «увидели» клетки иммунной системы. Если среди этих фрагментов будет неоантиген, это может вызвать противораковый иммунный ответ.

Пептиды MHC I класса распознают CD8+ Т-клетки (быстрый ответ, уничтожение клетки), пептиды MHC II класса — CD4+ Т-хелперы, координирующие иммунный ответ и отвечающие за клеточную память. Задача разработчиков персонализированных вакцин — подобрать конструкцию, вызывающую оба типа ответа. Очевидно, что неоантигены, которые присутствуют в опухоли, такой ответ вызывают не всегда.

В число неоантиген-специфических подходов входят мРНК-, ДНК- и пептидные вакцины, TIL-терапия, TCR-T-терапия, а также комбинации этих подходов с классической иммунотерапией. Преимущество мРНК-вакцины в том, что мРНК интегрируется в клетку, и она сама начинает производить нужные неоантигены, как «завод внутри организма», в то же время, например, пептиды быстро расходуются после введения, и требуются повторные дозы.

Собственное исследование: меланома как модель

За последние полтора года молекулярно-генетическая служба НМИЦ радиологии набрала значительный объем биоматериала, исследованного c помощью ПЦР, секвенирования по Сэнгеру и NGS. Опираясь на этот опыт, команда занялась разработкой интегрального молекулярно-биологического подхода как основы для создания персонифицированных препаратов. Имея данные секвенирования, исследователи хотят получить на выходе конкретные неоантигены.

Прежде чем переходить к разработке самого алгоритма, команда успешно провела валидацию исходных методов диагностики. По герминальным мутациям (эксперимент с раком молочной железы) результаты ПЦР и NGS совпали полностью. По соматическим мутациям проверка была шире: если для герминальных брали три гена, то здесь — большее их число, а выборка составила несколько сотен образцов. Расхождения были, но объяснимые: чувствительность ПЦР как метода выше, чем у NGS, и там, где доля опухолевых клеток в образце была низкой (например, около 3%), ПЦР еще улавливала мутацию, а NGS ее пропускало. Вывод, который сделал лектор: «Не берите опухоль с низкой клеточностью в работу, если хотите избежать ложноотрицательных результатов». По микросателлитной нестабильности — биомаркеру, важному для назначения иммунотерапии, — методы продемонстрировали стопроцентную сходимость.

Результаты валидации, по словам Петра Шаталова, полностью устроили команду, и работа продолжилась. Была создана научная платформа — банк геномных данных, объединяющий и сами данные, и программы для их обработки, и хранилища, — которая позволяет проводить многокогортные исследования на десятки тысяч образцов и с помощью искусственного интеллекта планировать дальнейшие эксперименты.

Почему меланома

Меланому выбрали в качестве модели для изучения неоантигенов, поскольку в ней часто бывает много соматических мутаций, которые могут создавать новые мишени для иммунной системы. Благодаря этому на примере меланомы легче изучать, как можно усилить противоопухолевый иммунный ответ. Задача, которую поставила перед собой команда, — совершенствовать алгоритм отбора неоантигенов именно при меланоме кожи.

Для этого взяли 15 пациентов, которым провели полногеномное, полноэкзомное и полнотранскриптомное секвенирование. В дальнейшем выяснилось, что полногеномное секвенирование для данной задачи избыточно: его результаты отличалось от полноэкзомного всего на 0,3%.

Получившийся алгоритм отбора неоантигенов оказался довольно сложным, отметил лектор. Подбор и приоритизация неоантигенов — процесс, включающий интеграцию разных типов входных данных, первичный их анализ, подготовку кандидатных пептидов, их предсказание, последующий отбор, скоринг и сборку итоговой конструкции, которую потенциально можно вводить пациенту.

План эксперимента в общих чертах выглядит так: формирование когорты, секвенирование, обработка данных, приоритизация итоговых пептидов (изначально их выявляется довольно много, но в дальнейшую работу идут только лучшие), а затем синтез и оценка иммунного ответа.

Сама схема фильтрации и приоритизации пептидов включает четыре этапа. На этапе геномной фильтрации оставляют мутации, надежно выявленные по данным секвенирования. Затем транскрипционная: берутся только те, которые не просто хорошо выявляются, но и активно экспрессируются в клетке — «мы хотим воздействовать на то, чего в клетке много, и не хотим воздействовать на то, чего в клетке мало». Дальше идет иммунологическая фильтрация: как уже было сказано, кандидатные неоэпитопы подбираются так, чтобы вызывать ответ и по MHC класса I, и по MHC класса II (то есть активировать и цитотоксические Т-клетки, и продукцию антител против неоантигенов). Для этого используют два типа пептидов, покороче и почти вдвое длиннее, чтобы итоговая молекула вызвала комплексный иммунный ответ, который сохранился бы надолго. И наконец, экспериментальная валидация.

Изначально на выходе алгоритма получается порядка 20–30 неоантигенов, при этом приоритизация учитывает несколько параметров: насколько хорошо пептид связывается с молекулами MHC, насколько он отличается от пептида «дикого типа» (того же участка белка, но без мутации; нежелательно было бы получить иммунный ответ против нормального белка), насколько активно экспрессируется и насколько хорошо покрыт данными секвенирования.

Проверка в клинике

Все кандидатные пептиды, отобранные алгоритмом, синтезируются в лаборатории и проверяются методом ELISpot: у пациента берут кровь, выделяют из нее Т-клетки, помещают их в лунки планшета и добавляют исследуемый неоантиген. Если Т-клетки его узнают, они активируются, а специальные антитела на дне лунки улавливают сигнал (например, интерферон гамма, который секретируют активные клетки), и появляется синее окрашивание. Так определяют, вызовет ли кандидатный неоантиген иммунный ответ при взаимодействии с лимфоцитами конкретного пациента.

В финальной валидации участвовали 15 человек и 18 пептидов; провели дозозависимый тест — для пептидов разной длины и разной концентрации смотрели на выраженность иммунного ответа. Около 60% кандидатных пептидов, одобренных базовой версией алгоритма, вызвали у пациентов иммунный ответ. Это, по оценке лектора, неплохой результат, но сейчас команда готовит значительно более крупную вторую серию эксперимента. В дополнение к меланоме, в него будут включены колоректальный рак и рак легкого, а размер выборки увеличится с 18 пептидов до 450.

Неоантигены, заключил Петр Шаталов, — перспективные персонализированные мишени для создания противоопухолевых вакцин и клеточной терапии. Накопленные данные о нуклеиновых кислотах опухоли позволяют перейти от молекулярного профиля конкретного пациента к поиску его индивидуальных неоантигенов. Совместно с Институтом системного программирования и Центром им. Н.Ф. Гамалеи лектор и его коллеги разработали интегральный конвейер, который включает анализ вариантов, HLA-типирование и оценку экспрессии для отбора наиболее перспективных неоантигенов. В пилотном режиме с использованием этой технологии уже начато введение препарата первому пациенту. Команда планирует значительно расширить эту работу.

Дискуссия после лекции получилась живой и местами острой. На вопрос об истории с австралийцем, который с помощью ИИ самостоятельно подобрал мРНК-вакцину, чтобы вылечить рак кожи у своей собаки, Петр Шаталов ответил, что современный ИИ действительно способен решить практически любую задачу — вопрос лишь в качестве результата. При грамотном экспертном подходе доля рабочих молекул стремится к 60%, а при обращении к чатботу — скорее к 25–30%. Своей собаке он бы такое колоть не стал, но ему было бы интересно ознакомиться с результатами.

На вопрос о принципе действия неоантигенных препаратов лектор специально уточнил, что неоантигены — это мутированные белки, которые синтезируются самой опухолевой клеткой. Они «новые» в том смысле, что их нет в здоровых тканях пациента, и иммунная система воспринимает их как чужеродные. Однако в естественных условиях опухоль умеет прятать эти антигены или подавлять ответ на них. Задача неоантигенного препарата — показать иммунитету эти самые белки в «опасном» контексте, чтобы он научился их видеть и атаковать клетки, где они есть.

На вопрос о возможных неограниченных ресурсах для улучшения неоантигенной терапии, Петр Шаталов назвал ключевое направление — переход к анализу единичных клеток (single-cell), который позволит учитывать неоднородность опухоли и лечить разные клеточные популяции по-разному. По его оценке, такой подход может повысить точность отбора мишеней с нынешних 60% до 80%.