Предложен быстрый метод выделения антител к S-белку коронавируса

Обычно выделение антител, которые организм человека вырабатывает против инфекции, их описание и разработка терапии на их основе занимают от нескольких месяцев до нескольких лет. В случае SARS-CoV-2 есть необходимость ускорить этот процесс. Ранее группа исследователей из США разработала методику ускоренного выделения человеческих молоклональных антител к вирусу Зика из суспензии B-клеток и их последующего анализа. Весь процесс занимал 2,5 месяца.

В новой работе эта же команда адаптировала методику к SARS-CoV-2 и добавила проверку активности антител, выделенных из отдельных B-клеток, что сократило время анализа до 18 дней от момента выделения клеток из образца. Ученые использовали домены S-белка оболочки вируса: стабилизированный тримерный эктодомен в конформации до слияния (SP2_ecto), рецептор-связывающий домен (S_RBD) и рекомбинантный N-концевой домен (S_NTD).

Исследователи работали с образцами крови четырех пациентов, заразившихся в Китае, и одного здорового донора для негативного контроля. У двух пациентов (1 и 2) образцы взяли через 35–36 дней после появления симптомов, у двух других (3 и 4) — через 50. ИФА показал, что в крови всех пациентов были антитела, связывающие все три домена SARS-CoV-2, а также эктодомен SARS-CoV. С помощью магнитных шариков с антителами из образцов выделили B-клетки и охарактеризовали их популяции на цитометре с помощью окрашивания поверхностных молекул. Далее из популяции B-клеток памяти авторы выделили антиген-реактивные клетки (к SP2_ecto и RBD). У пациентов 3 и 4 было значительно больше подобных клеток, чем у пациентов 1 и 2, поэтому образцы 3 и 4 объединили.

Полученные клетки культивировали в специальной среде, продуцируемые ими антитела в культуральном супернатанте были способны нейтрализовать штамм WA1/2020 SARS-CoV-2. Половину культивированных клеток отправили сразу на секвенирование РНК единичных клеток, чтобы определить и синтезировать гены, кодирующие антитела. Другую половину загрузили в оптофлюидный прибор для анализа активности антител единичных клеток. В приборе есть множество каналов, в каждый из которых помещается одна клетка, в пространстве над каналами находятся частицы с антигенами. Связывание специфичных антител с антигенами определяется по флуоресцентному сигналу.

Выяснилось, что примерно 55% культивируемых B-клеток секретируют антитела к SP2_ecto. Кроме того, несколько клонов синтезировали антитела, блокирующие связывание RBD с клеточным рецептором ACE2. Антиген-реактивные B-клетки, идентифицированные в оптофлюидном приборе, также отправили на секвенирование генов легких и тяжелых цепей антител.

Найденные двумя способами гены антител клонировали в векторы для экспрессии в клеточной культуре. Таким образом было получено 389 рекомбинантных человеческих моноклональных антител. Способность антител связывать антигены подтвердили с помощью ИФА, а нейтрализующую активность — с помощью высокопроизводительного скрининга. Антитела разделили на пять групп по типу связываемого домена и кросс-реактивности с SARS-CoV. Из 70 нейтрализующих антител 67 связывались с RBD: этот домен служит основной мишенью естественных антител пациентов. Нейтрализующую активность также подтвердили на вирусе везикулярного стоматита, экспрессирующем S-белок.

Исследователи передали последовательности для производства терапевтических моноклональных антител через 18 дней после выделения B-клеток из образцов крови пациентов. Авторы отмечают, что от первых симптомов до появления зрелых B-клеток в организме пациента должно пройти около 50 дней (у пациентов спустя 35–36 дней почти не было зрелых клеток).