PROPER-seq — новый метод для выявления белок-белковых взаимодействий на транскриптомном уровне

Метод PROPER-seq основан на конъюгации белков с их собственной мРНК в процессе трансляции. После синтеза кДНК, лигирования и секвенирования выявляются пары последовательностей, оказавшихся сближенными в результате белок-белкового взаимодействия. Ученые из США, разработавшие метод, утверждают, что его мощность позволяет проанализировать все возможные взаимодействия в пуле из 10 000 белков.

Credit:
Zhong Lab | Пресс-релиз

Ученые из США предложили новый подход к выявлению белок-белковых взаимодействий — PROPER-seq. Его применили к клеточным линиям HEK293T, Jurkat (T-лимфоциты) и HUVEC (эндотелиальные клетки) и выявили 210 518 взаимодействий, в которые вовлечены 8 635 белков. В результате построили карту.

При этом 1365 и 2480 взаимодействий уже были аннотированы ранее, по данным ко-иммунопреципитации и аффинной очистки, совмещенной с масс-спектрометрией, соответственно. Еще 17 638 были предсказаны, но не имели экспериментального подтверждения. Новый метод также выявил 100 взаимодействий пар белков, одновременный нокаут которых летален. Кроме этого, существование четырех ранее не известных партнеров белка PARP1 — XPO1, MATR3, IPO5 и LEO1 авторы подтвердили in vivo методом ко-иммунопреципитации и in situ методом близкого лигирования ( proximity ligation assay, PLA).

Метод PROPER-seq является комбинацией трех подходов. Первый из них — SMART-дисплей — позволяет создать библиотеку белков, каждый из которых конъюгирован с собственной мРНК. Для этого из клеток выделяют все имеющиеся мРНК и на их основе, с использованием обратной транскрипции и ПЦР, создают библиотеку ДНК, содержащих участки для старта транскрипции и трансляции, а также сайт для гибридизации пуромицин-содержащего линкера. В процессе in vitro трансляции мРНК, лигированной с пуромицином, формируется гибрид белка с его собственной мРНК, так как пуромицин имитирует аминоацил-тРНК, входит в А-сайт рибосомы и присоединяется к белковой цепи.

Второй подход — INLISE — это получение ДНК на матрице мРНК, осуществление белок-белковых взаимодействий и лигирование двух сближенных молекул ДНК. Далее полученная библиотека секвенируется. Третий подход — это анализ данных секвенирования с использованием программного обеспечения PROPERseqTools.

Важнейшие преимущества метода — это скорость и универсальность. Так, PROPER-seq не требует использования антител. Тем не менее, есть ряд серьезных ограничений, которые могут вносить ошибки в полученные результаты. Прежде всего, это in vitro метод, а значит, он не учитывает влияние возможных посттрансляционных модификаций и локализации белков. Тип клеток, фаза клеточного цикла и другие особенности также остаются неучтенными. Кроме того, нельзя исключить вклад ДНК-белковых взаимодействий или влияние РНК-тега на структуру белка. Для белков, находящихся в большом количестве, возможны ложноположительные результаты. Метод также никак не разделяет непосредственные белок-белковые взаимодействия и взаимодействия в составе комплекса, опосредованные другими белками.

Таким образом, с учетом ограничений метода, полученные данные должны быть валидированы другими способами. Однако PROPER-seq может задать направление для дальнейших исследований.

Источник

Johnson K.L., et al. // Revealing protein-protein interactions at the transcriptome scale by sequencing // Molecular Cell, 81, 1, 2021. DOI: 10.1016/j.molcel.2021.07.006

Добавить в избранное

Вам будет интересно