Ранние признаки болезни Альцгеймера связаны с дисбалансом кальция в лизосомах

При болезни Альцгеймера в нейронах рано появляются эндосомальные и лизосомальные нарушения — они наблюдаются еще до появления амилоидных бляшек. Авторы статьи в Developmental Cell задались вопросом, как дефекты эндолизосом организованы во времени и какой вклад в них вносят изменения функции γ-секретазы или метаболизм белка-предшественника амилоида (APP) — и показали, что накопление фрагментов APP нарушает работу эндолизосомальной системы.

Пресенилины 1 и 2 (PSEN1 и 2) — каталитические субъединицы γ-секретазы, которые расщепляют APP, в результате чего образуются пептиды амилоида β (Aβ) различной длины. Мутации в генах APP и PSEN снижают активность γ-секретазы, что приводит к продукции более длинных пептидов Aβ и ускоряет формирование бляшек в мозге. Также в патогенез болезни Альцгеймера вовлечена лизосомальная дисфункция — это подтверждают как анализ посмертных образцов, так и генетические данные. В настоящее время считается, что важную роль в нарушении функции лизосом могут играть C-концевые фрагменты APP.

Чтобы узнать, какая последовательность событий приводит к нарушению работы эндолизосомальной системы, исследователи провели опыты на эмбриональных мышиных фибробластах. Клетки дикого типа обрабатывали ингибитором γ-секретазы (DAPT) в течение четырех дней. После такой обработки клетки быстро накапливали APP-CTF с лизосомах и поздних эндосомах. Это накопление сильно коррелировало со значительно сниженным содержанием лизосомального Ca²⁺. Анализ эндосомальных компартментов показал увеличение VPS35⁺-органелл — это указывает на нарушение рециркуляции эндосом. Авторы отмечают, что это происходило только через три дня обработки, то есть уже после того, как лизосомы были затронуты. Ранние эндосомы также увеличивались в размере, однако это происходило еще позже — на четвертый день. APP-CTF, как показал дальнейший анализ, локализовались в нарушенных ранних и поздних рециркулирующих эндосомах. Этот результат авторы воспроизвели на первичных нейронах гиппокампа мыши.

Учитывая связь между процессингом APP и дефектами эндолизосом, обнаруженную в том числе и другими учеными, авторы этой работы решили подробнее исследовать роль APP-CTF. Они нокаутировали пресенилины в мышиных эмбриональных фибробластах, чтобы получить модель дисфункции γ-секретазы. В лизосомах таких клеток существенно снижался уровень Ca²⁺, как и в эксперименте с ингибированием γ-секретазы с помощью DAPT. Убедившись, что изменения pH остаются в пределах физиологической нормы для лизосом, а АТФазы V-типа функционируют нормально (и даже активнее, чем в клетках дикого типа), авторы заключили, что именно снижение уровня кальция приводит к лизосомальным дисфункциям при дефиците γ-секретазы. Также оказалось, что делеция APP в этих клетках восстанавливала их фенотип — эндосомальный компартмент в этом случае возвращался в норму.

Дальнейшие опыты ученые проводили на клетках с нокаутом пресенилина и APP. Повторное введение в них полноразмерного APP или его α- или β-C-концевых фрагментов показало: реэкспрессия APP-α- или βCTF вызывала в клетках дефект рециркуляции эндосом точно так же, как и полноразмерный белок, и влияла на кальциевый гомеостаз в лизосомах. Раньше считалось, что ключевую роль в нарушении эндосомального компартмента играет только βCTF.

Авторы предположили, что APP-CTF стимулируют клеточный сигналинг, и клеткам необходимо держать уровень этих белков под контролем при помощи γ-секретазы. Чтобы проверить эту гипотезу, исследователи экспрессировали в нокаутных по пресенилину и APP клетках еще один фрагмент APP — его внутриклеточный C-концевой домен (AICD), который они закрепляли на мембране с помощью миристоилового якоря. Такая экспрессия воспроизводила дефекты эндолизосом — концентрация кальция в лизосомах снижалась, объемы ранних эндолизосом увеличивались, а эндолизосомальная рециркуляция нарушалась. Мутации в AICD или ингибирование белков, взаимодействующих с ним в норме, компенсировали этот эффект. Получается, ингибирование сигналинга, в котором участвуют фрагменты APP, облегчает эндолизосомальные дефекты.

Проанализировав возможные причины изменения кальциевого гомеостаза в органеллах, авторы работы показали, что снижение содержания Ca²⁺ в лизосомах происходит из-за нарушения их взаимодействий с эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР). APP-CTF, накопившийся в клетке, локализовался в местах контакта лизосом с ЭПР и мешал нормальной динамике их взаимодействия. Кроме того, развитию дисфункции эндолизосом предшествовало накопление холестерина, стимулированное кальциевым дисбалансом.

Авторы работы показали, что снижение содержания кальция в лизосомах функционально связано с накоплением APP-CTF или других заякоренных на мембране фрагментов APP. Это нарушение кальциевого гомеостаза вместе с накоплением холестерина — два основных события, предшествующих развитию дисфункции эндолизосом при хроническом ингибировании γ-секретазы, из-за которого APP-CTF накапливались в клетке.

«В результате [накопления] APP-CTF нарушают хрупкий баланс кальция в лизосомах, — объясняет доктор Марин Брету, первый автор исследования. — Это нарушение запускает каскад событий. ЭПР больше не может эффективно пополнять лизосомы кальцием, что приводит к накоплению холестерина и снижению их способности расщеплять клеточные отходы. В результате разрушается вся эндолизосомальная система — важнейший путь, поддерживающий здоровье нейронов».

Накопление бета-амилоида в нейронах при болезни Альцгеймера регулируется холестерином