Расшифрована структура активного Сas9

Система CRISPR/Cas9 была открыта в бактериях как часть их противовирусного иммунитета. Но ее можно использовать и в генной инженерии — преимущества CRISPR/Cas9 быстро сделали ее самым распространенным инструментом для редактирования генома.

Структуру фермента Cas9 ранее исследовали с помощью рентгенострутурного анализа. Однако из-за ограничений метода приходилось использовать неактивный Cas9 либо кристаллизовать его в отсутствие ионов магния (без которых фермент тоже не работает). Авторы статьи, опубликованной в Nature Structural&Molecular Biology, применили криоэлектронную микроскопию, которая позволила получить различные структуры активного комплекса Cas9-РНК-ДНК из Streptococcus pyogenes в процессе разрезания ДНК с высоким разрешением.

Три конформации фермента соответствуют разным стадиям связывания и разрезания ДНК. Конформация I возможна только в присутствие магния. В ней «узнающий» домен проверяет, правильно ли взаимодействует РНК, связанная с Cas9, с целевой ДНК. В конформации II нуклеазные домены приближаются к ДНК и разрезают обе цепи (что сопровождается прочими конформационными изменениями), а в конформации III все возвращается к изначальному состоянию. Одной из неожиданных черт выявленного механизма оказалось то, что некоторые домены быстро меняют свою позицию или форму, в то время как другие остаются неподвижными.

Понимание структуры Cas9 и механизма его работы очень важно для использования фермента в целях редактирования генома, поскольку позволит определить перспективные направления его модификации. Например, изменения в нуклеазных доменах могут влиять на скорость разрезания, а изменение части белка, взаимодействующей с ДНК, может увеличить процессивность Cas9. Таким образом, стали яснее возможные подходы к получению ферментов Cas с различными свойствами.

Источник

Xing, Zhu, et al // Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9 // Nature Structural&Molecular Biology. 2019; DOI: 10.1038/s41594-019-0258-2