Растительный редактор оснований может работать в человеческой клетке

Редактирование оснований в митохондриальных транскриптах, а именно превращение C в U, у растений было открыто более трех десятилетий назад. Оно используется в основном для восстановления консервативных кодонов. Примерно в то же время было открыто редактирование РНК-оснований у животных. Эти процессы у растений и животных сильно различаются. Ученые из Германии проверили, сможет ли растительная система редактирования митохондриальных РНК-оснований редактировать ядерные транскрипты в цитозоле животных клеток.

Они сконструировали два растительных редактора митохондриальных РНК-оснований, взяв за основу белки мха Physcomitrium patens, содержащие пентратрикопептидные РНК-связывающие повторы (pentatricopeptide repeat, PPR). C-концевой DYW-домен (назван по консервативному мотиву аспартат-тирозин-триптофан, D-Y-W) этих белков отвечает за дезаминазную активность и превращение C в U. Таким образом, PPR-белки выполняют двойную функцию: связывают РНК-мишень и редактируют ее.

Ранее эта же команда ученых показала, что инженерные PPR-белки PPR56 и PPR65 успешно редактируют свои митохондриальные мишени nad4eU272SL и ccmFCeU103PS в гетерологичной экспрессионной системе на основе Escherichia coli. В новой работе они оптимизировали PPR56 и PPR65 для экспрессии в животной клетке, пришив к ним различные варианты белковых тегов, и протестировали конструкты на человеческих клеточных линиях. Человеческие клетки трансфицировали векторами, содержащими последовательности редакторов и их нативных митохондриальных мишеней. Эффективность редактирования мишеней редакторами PPR56 достигала 72%, редакторами PPR65 — 62%. Бόльшая эффективность PPR56 согласуется с результатами предыдущих исследований. Авторы отмечают, что работа PPR-белков сильно зависела от типа клеток.

С помощью РНК-секвенирования ученые обнаружили значительную нецелевую активность PPR-белков в клетках человека. Так, в линии легочных фибробластов IMR-90 количество нецелевых сайтов в эндогенных транскриптах, отредактированных PPR56, превышало 900. Максимальная эффективность редактирования нецелевых сайтов составила 91%. При этом ряд сайтов, которые, согласно расчетам, были хорошими кандидатами для нецелевого редактирования, PPR56 не тронул. Это может быть связано с их недоступностью для растительного редактора из-за особой вторичной структуры транскрипта или с дополнительной защитой РНК-связывающими белками.

В дальнейших экспериментах с PPR56 ученые показали, что внесение определенных мутаций в РНК-связывающий мотив приводит к предсказуемым изменениям мишени.

Авторы заключают, что растительные редакторы РНК-оснований, которые в случае P. patens работают только в митохондриях, хорошо редактируют ядерные транскрипты в эволюционно далеких от мха животных клетках. Однако чтобы понять возможность предотвращения нецелевых событий редактирования и использования PPR-белков для точных геномных манипуляций, нужно продолжать исследования.

Редакторы цитозина на основе CRISPR вносят много нецелевых мутаций